郭亞煥，陸建榮，廖子君，張彥兵

論著·臨床

自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3在結(jié)腸癌組織中的表達及臨床意義

郭亞煥，陸建榮，廖子君，張彥兵

目的 探討自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3在結(jié)腸癌組織中的表達及臨床意義。方法 收集2011年1月—2014年1月結(jié)腸癌患者80例，取結(jié)腸癌組織標本及相應(yīng)的正常組織標本各80份。用免疫組化法檢測結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達,分析二者和結(jié)腸癌臨床病理學參數(shù)，包括年齡、分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。結(jié)果 結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中Beclin1的陽性表達率分別為33.8% (27/80)、73.8% (59/80)，LC3陽性表達率分別為22.5% (18/80)、68.8% (55/80)，Beclin1和LC3在結(jié)腸癌的陽性表達率顯著低于正常結(jié)腸組織(P<0.01)。不同年齡、分化程度結(jié)腸癌組織中Beclin1和LC3的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而不同TNM分期(P<0.01)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織中Beclinl和LC3表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論 自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的低表達可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后不良有關(guān)。

結(jié)腸癌；Beclin1；LC3；自噬；免疫組化

結(jié)直腸癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居男性惡性腫瘤第3位和女性第2位，不同地區(qū)發(fā)病率和病死率差異較大，我國為大腸癌的高發(fā)地區(qū)，在2012年公布的數(shù)據(jù)中，我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)為25.3萬例，占全球大腸癌新發(fā)病例的18.6%[1]。早期大腸癌主要以手術(shù)為主，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療失敗的原因，不良預(yù)后因素主要包括年齡、病理分期晚、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓等，但是這些因素是否能夠精確判斷預(yù)后目前尚無定論，因此，研究大腸癌的分子生物學特征及與預(yù)后的關(guān)系成為目前的研究重點。自噬(autophagy)是細胞降解被損害的細胞器和蛋白質(zhì)的過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用。Beclinl蛋白含有BH3結(jié)構(gòu)域, LC3基因是哺乳動物中酵母ATGS基因的同源物, 兩者均在哺乳動物的自噬泡形成過程中發(fā)揮重要作用[2～6]。

現(xiàn)分析自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達差異，及二者與結(jié)腸癌臨床病理學參數(shù)的關(guān)系，探討自噬與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 (1)組織標本： 收集陜西省腫瘤醫(yī)院2011年1月—2014年1月治療的結(jié)構(gòu)癌患者80例，所有患者均接受結(jié)腸癌根治術(shù)，均經(jīng)病理確診為結(jié)腸腺癌?；颊吣?8例，女32例，年齡29～79歲，中位年齡50歲。每例均取結(jié)腸癌組織標本及相應(yīng)的正常結(jié)腸組織標本。(2)主要試劑：Beclin1小鼠抗人單克隆抗體和LC3B兔抗人單克隆抗體，二抗生物素化山羊抗小鼠IgG/兔IgG均購自Abcam(USA)；鏈霉親和素—生物素復(fù)合物(SABC)試劑盒和DAB顯色液均購自武漢博士德生物工程有限公司。(3)倒置顯微鏡：奧林巴斯(CKX41-A32RC)購自奧林巴斯(北京)銷售服務(wù)有限公司。

1.2 觀測方法 采用免疫組化SABC法，所有標本均應(yīng)用10%的福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm；將石蠟組織切片放置在60℃烘箱內(nèi)烘烤60 min；石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水、水化；3%過氧化氫去離子水封閉，室溫下孵育20 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性；檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復(fù)；山羊血清封閉，37℃下孵育40 min；一抗(Beclin1和LC3B 1∶200)4℃冰箱孵育過夜；生物素化山羊抗小鼠IgG/兔IgG，37℃下孵育30 min；SABC，37℃下孵育30 min；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；酒精脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。陰性對照以PBS代替一抗。

1.3 結(jié)果判定 由2位病理科醫(yī)生采用盲法獨立閱片，Beclin1和LC3均為胞漿表達，陽性染色為棕黃色均勻染色，倒置顯微鏡(10×20倍)鏡下隨機選取5個視野，每個視野分別計數(shù)陽性細胞數(shù)，評分標準[7]：0分, 無或有弱的染色; 1分, 平均陽性細胞數(shù)與總計數(shù)細胞的比例≤30%; 2分,平均陽性細胞數(shù)與總計數(shù)細胞的比例>30%。染色強度評分標準：0分, 陰性;1分, 淡黃色; 2分, 黃色; 3分, 棕黃色。蛋白表達的分級：陽性細胞百分數(shù)評分與染色強度評分的乘積： 0～1分為陰性；低表達2～4分為高表達：5～6分為陽性[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Beclin1和LC3在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織的表達率 結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中Beclin1的陽性表達率分別為33.8%(27/80)、 73.8%(59/80)，結(jié)腸癌顯著低于正常結(jié)腸組織(χ2=25.745，P=0.000)；LC3陽性表達率分別為22.5% (18/80)、 68.8% (55/80)，結(jié)腸癌顯著低于正常結(jié)腸組織(χ2=34.489，P=0.000)。見表1，圖1(見封3)。

表1 Beclin1和LC3在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織的表達率 [例(%)]

2.2 Beclin1和LC3的表達與結(jié)腸癌臨床病理學參數(shù)的關(guān)系 不同年齡、腫瘤分化程度結(jié)腸癌患者均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同pTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Beclin1的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。不同年齡、腫瘤分化程度結(jié)腸癌患者LC3的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；不同pTNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

3 討 論

目前普遍認為在多種類型的惡性腫瘤中均存在自噬活性的異常，在腫瘤發(fā)生的早期，自噬受抑將導致氧化磷酸化解耦聯(lián)的線粒體等衰老損傷的細胞器堆積，ROS等致癌物質(zhì)產(chǎn)生增多，導致染色體的不穩(wěn)定性增加，使抑癌基因失活或癌基因被激活，導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化；在腫瘤進展的晚期，隨著腫瘤體積的不斷增大，細胞處于乏氧和營養(yǎng)缺乏的狀態(tài)，此時自噬激活作為一種生存機制維持腫瘤細胞在不利環(huán)境下的存活，促進腫瘤的生長[8]。

表2 Beclin1和LC3的表達與結(jié)腸癌臨床病理學參數(shù)的關(guān)系 [份(%)]

本結(jié)果顯示Beclin1和LC3在結(jié)腸癌的陽性表達率顯著低于正常結(jié)腸組織，提示腫瘤組織的自噬活性顯著降低。目前一些研究有類似的結(jié)果，Zhu等[9]采用免疫組化法檢測Beclin1和LC3蛋白在宮頸鱗癌和正常宮頸組織的表達，結(jié)果顯示宮頸癌組織Beclin1和LC3的表達顯著低于正常宮頸組織。有學者研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌Beclin1和LC3的表達低于正常乳腺組織，Beclin1基因的過表達抑制乳腺上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化；而Beclin1基因的下調(diào)促進了乳腺上皮細胞的癌變[10]。Jiang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)與正常肺組織比較，Beclin1和LC3的表達在肺癌組織顯著降低?；谖覀兊难芯亢蜕鲜鰣蟮?，我們認為自噬活性的降低與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)，自噬可能是阻礙腫瘤發(fā)生的屏障，在腫瘤進展的早期，自噬的缺陷會使細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的能力降低，導致細胞惡變的幾率增加，促進惡性腫瘤的發(fā)生。但是，目前還有一些研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的自噬活性增強，Wu等[12]的研究表明結(jié)腸癌組織Beclin1和LC3的表達與鄰近正常組織比較顯著增高，Park等[13]的研究顯示膽囊癌組織Beclin1和LC3的表達顯著高于正常膽囊組織。這些不同的結(jié)果可能與自噬對細胞的雙重作用有關(guān)，在癌變的早期，自噬水平下降使癌基因活化和抑癌基因失活，使細胞中過多堆積衰老的細胞器，導致正常細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞。而在惡性腫瘤發(fā)展的晚期，由于癌細胞不斷生長和增殖，細胞內(nèi)部出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏和缺氧的狀況，并且癌細胞自身代謝水平較高，對能量和營養(yǎng)的需求較高，此時微環(huán)境的壓力使癌細胞內(nèi)的自噬激活，維持癌細胞在不利環(huán)境下的生存，并且不同類型腫瘤的自噬能力在其發(fā)展的不同階段也存在很大差異[14，15]。

本結(jié)果顯示Beclin1和LC3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負相關(guān)， 有學者在胃癌中觀察到了類似的結(jié)果[16]，提示自噬活性的減低促進了惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在惡性腫瘤進展的晚期，細胞內(nèi)的自噬在微環(huán)境的壓力下被激活，使腫瘤細胞在缺氧和營養(yǎng)缺乏的條件下生存能力提高，并獲得了更強的轉(zhuǎn)移能力。值得注意的是，目前自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未完全明確，不同的腫瘤類型，不同的發(fā)展階段細胞具有不同的自噬能力，對預(yù)后會產(chǎn)生不同的影響，因此，開展更多大樣本的研究明確自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是十分必要的。

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Expressions and clinical significance of autophagy related protein Beclin1 and LC3 in colon cancer

GUOYahuan*,LUJianrong,LIAOZijun,ZHANGYanbing.*DepartmentofMedicalOncology,TumorHospitalofShanxiProvince,Xi’an710061,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of autophagy related protein Beclin1 and LC3 in colon cancer tissues.Methods Eighty cases of colon cancer patients were collected from January 2011 to January 2014, 80 cases of colon cancer tissues and corresponding normal tissues were collected. The expression of autophagy related proteins LC3 and Beclin1 in colon cancer and normal colon tissues were detected by immunohistochemical method, and the relationship between protein Beclin1 and LC3 and age, differentiation, TNM stage and lymph node metastasis were analyzed.Results Positive expression rate of Beclin1 in colon carcinoma and normal colon tissue were 33.8% (27/80) and 73.8% (59/80), LC3 positive expression rate was 22.5% (18 / 80), 68.8% (55 / 80), Beclin1 and LC3 positive expression in colon cancer rate was significantly lower than that in normal colon tissue (P<0.01). Different age, degree of cancer tissue’s Beclin1 and LC3 expression had no statistical significance differences (P>0.05), and different TNM staging (P<0.01) and lymph node transfer in the colorectal cancer tissue’s Beclin1 and LC3 expression showed statistically significant differences (P<0.01).Conclusion Low expression of autophagy related proteins Beclin1 and LC3 may be related to the development and prognosis of colon cancer.

Colon cancer; Beclin1; LC3; Autophagy; Immunohistochemistry

陜西省科學技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(No.2011JM4005)

710061 西安，陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科(郭亞煥、廖子君、張彥兵)，病理科(陸建榮)

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.018

2015-06-26)