杜 巖， 李立楠， 方步武

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 天津 300070)

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青蒿琥酯抑制肝纖維化的作用及其機制*

杜 巖， 李立楠， 方步武△

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 天津 300070)

目的：探討青蒿琥酯(Art)對人源肝星狀細胞(LX-2)的作用。方法：樣本為體外培養(yǎng)人源肝星狀細胞，實驗分為對照組及3個不同劑量的Art(250、350、450 μmol/L)組。四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測LX-2的增殖情況，HPLC-FLD法檢測LX-2上清中神經(jīng)酰胺的含量，酶消化法測定羥脯氨(Hyp)的含量，Western blot法檢測PPAR-γ、p53、Caspase 3蛋白在各組中的表達。結(jié)果：與對照組比較,不同濃度青蒿琥酯組對肝星狀細胞增殖均有明顯抑制作用，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)；青蒿琥酯可提高神經(jīng)酰胺的含量(P<0.01)，同時各給藥組羥脯氨酸的含量明顯下降(P<0.05，P<0.01)；與對照組比較，青蒿琥酯組PPAR-γ、p53、Caspase 3蛋白的表達上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論：青蒿琥酯可能是通過上調(diào)神經(jīng)酰胺，發(fā)揮抑制肝星狀細胞增殖、促進其凋亡的作用。

青蒿琥酯； 肝纖維化； 神經(jīng)酰胺； PPAR-γ； p53； Caspase 3

肝纖維化(hepatic fibrosis)是慢性肝損傷后組織修復(fù)過程的代償反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肝星狀細胞的增殖活化，活化的肝星狀細胞增殖、分化、收縮、粘附能力均增強，膠原分泌增多，使細胞外基質(zhì)的沉積與降解失衡，肝臟功能受到破壞[1]。肝纖維化的治療途徑主要有：(1)抑制炎癥和免疫反應(yīng)；(2)阻斷受體信號通路；(3)抗氧化損傷；(4)抑制肝星狀細胞的增殖與活化；(5)誘導(dǎo)肝星狀細胞的凋亡等。其中抑制肝星狀細胞的增殖活化，誘導(dǎo)其凋亡是肝纖維化研究的熱點[2]。神經(jīng)酰胺為細胞內(nèi)的脂質(zhì)第二信使分子[3]，其與細胞的增長、分化、生長抑制和凋亡等活動有密切關(guān)系[4，5]。 神經(jīng)酰胺在腫瘤細胞凋亡的調(diào)控作用中已有很多報道，其在抗肝纖維化中尚未見報道。青蒿琥酯是具有β-倍半萜內(nèi)酯類青蒿素的衍生物，其抗瘧作用強，并具有抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用[6]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯具有保護肝臟的作用，能有效地抑制肝星性狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)增殖、促進細胞凋亡、減少膠原生成，但作用機制尚需進一步研究。本研究以人源肝星狀細胞株(LX-2)為研究對象，測定神經(jīng)酰胺含量等的變化，分析青蒿琥酯對其增殖、活化及凋亡的作用，進一步探討其抗肝纖維化的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞 人源肝星狀細胞株LX-2由北京市地壇醫(yī)院提供。

1.1.2 藥物及主要試劑 青蒿琥酯(artesunate，Art)(C19H28O8，Mr：384.42)由廣西桂林南藥股份有限公司贈與；DMEM與胎牛血清購自美國Gibico公司；鄰苯二甲醛(OPA，色譜純)、β-巰基乙醇(色譜純)購自Sigma-aldrich公司；PPAR-γ抗體購自Santa cruz公司，Caspase 3 購自Cell signaling technology 公司，Bata-actin抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所，羥脯氨酸檢測試劑盒購自南京建成試劑公司。

1.1.3 儀器 恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國NAPCOseries 5400)；680酶標儀(美國BIO-RAD公司)；日本島津高效液相色譜儀(LC-6A泵，SCL-6B系統(tǒng)控制箱；RF-535熒光檢測器；Anastar色譜工作站)，MSB010.CX2.5型臺式高速離心機(SANYO)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設(shè)計及分組 將LX-2細胞置于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，當其生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，加入0.25%胰蛋白酶1 ml, 37℃消化1 min,按1∶3或1∶4進行細胞傳代取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。細胞實驗分4組：(1)Control組:細胞對照組；(2)Art處理組：細胞用3個不同劑量Art(250、350、450 μmol/L)處理24 h。

1.2.2 MTT法檢測Art對LX-2增殖的影響 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，以2×104cells/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl,細胞分別根據(jù)細胞實驗設(shè)計進行處理，每組3個復(fù)孔。24 h孵育結(jié)束后，每孔加入MTT 10 μl，繼續(xù)孵育4 h，將培養(yǎng)基倒盡、吸干，每孔加入二甲基亞砜 200 μl，混勻后置酶標儀中570 nm測定各孔吸光度值(A值)，按以下公式計算細胞抑制率(inhibition rate，IR)，抑制率(%)=[(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值]×100%。

1.2.3 HPLC-FLD法測定細胞培養(yǎng)上清中C2神經(jīng)酰胺的含量 LX-2以2×104cells/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，分別根據(jù)細胞實驗設(shè)計進行處理，收集各實驗組作用24 h后的細胞培養(yǎng)上清液，取100 μl細胞培養(yǎng)上清液，加入等量的乙腈，漩渦振蕩混合均勻后，13 000 r/min離心3 min。吸取上清液，儲存于4℃冰箱中，待測，測定方法參考文獻[7](測定生物樣本中神經(jīng)酰胺含量的HPLC-FLD法)。

1.2.4 測定細胞培養(yǎng)上清液中羥脯氨酸含量 LX-2以 2×104cells/ml的密度接種于96孔板，每孔100 μl，分別根據(jù)細胞實驗設(shè)計進行處理。收集各實驗組作用24 h后的細胞上清液，按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書進行操作(南京建成生物工程研究所提供)。計算公式：羥脯氨酸濃度(μg/ml)=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管濃度(5 μg/ml)×樣本測試前稀釋倍數(shù)。1.2.5 Western blot檢測PPAR-γ、p53及Caspase 3蛋白的表達 將LX-2細胞以密度為5×104cells/ml接種于6孔板，分別根據(jù)細胞實驗設(shè)計進行處理,作用24 h后,裂解蛋白，使用BCA試劑盒檢測所提蛋白的濃度(按試劑盒說明書操作)。蛋白變性后取30 μg上樣，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳，全濕式電轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入PPAR-γ(1∶500)、p53(1∶1 000)及Caspase 3(1∶1 000)一抗封袋，4℃搖床上過夜，TBST緩沖液振蕩洗膜3次，每次10 min,加入稀釋好的二抗(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST緩沖液振蕩洗膜3次，每次10 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，再進行曝光。用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Art對HSCs LX-2增殖的影響

MTT檢測結(jié)果表明：不同濃度的Art作用于LX-2細胞24 h，與對照組比較，細胞增殖抑制率增加且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表1)，說明Art能抑制LX-2細胞的增殖。

GroupInhibition(%)Control —Art250μmol/L30.57±1.48** 35053.01±2.45**## 45073.43±2.11**##△△

Art: Artesunate； HSCs： Hepatic stellate cells

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsArt 250 μmol/L group;△△P<0.01vsArt 350 μmol/L group

2.2 Art對神經(jīng)酰胺含量的影響

我們通過HPLC-FLD法測定細胞培養(yǎng)上清液中神經(jīng)酰胺含量的變化，結(jié)果表明，Art處理LX-2細胞24 h后，與對照組比較，Art可呈劑量依賴性地升高神經(jīng)酰胺的含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。

2.3 Art對羥脯氨酸含量的影響

Art處理LX-2細胞24 h后，羥脯氨酸測定試劑盒測定結(jié)果顯示：各劑量組細胞上清液中的羥脯氨酸含量降低，且劑量越大，羥脯氨酸含量越低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表3)。

GroupCer(μg/ml)Control0.183±0.012Art250μmol/L0.482±0.011** 3500.628±0.006**## 4500.745±0.008**##△△

Art: Artesunate； HSCs： Hepatic stellate cells； Cer: Ceramide

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsArt 250 μmol/L group;△△P<0.01vsArt 350 μmol/L group

Group Hyp(μg/mL)Control2.811±0.070Art250μmol/L0.786±0.011** 3500.694±0.010**## 4500.620±0.007**##△

Art: Artesunate; Hyp: Hydroxyproline； HSCs： Hepatic stellate cells

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsArt 250 μmol/L group;△P<0.05vsArt 350 μmol/L group

2.4 Art 對PPAR-γ、p53及Caspase 3蛋白表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，對照組及給藥組均有PPAR-γ 、p53及Caspase 3蛋白的表達，對照組表達較少，不同劑量青蒿琥酯作用于LX-2細胞24 h后，PPAR-γ 、p53、Caspase 3蛋白表達上均明顯高于對照組(P<0.01)，且隨著Art劑量的增加，PPAR-γ、p53及Caspase 3蛋白表達灰度值呈明顯遞增(P<0.01，表4)。

Tab. 4 Effect of Art on PPAR-γ,p53 and Caspase protein expression

GroupPPAR-γ/β-Actinp53/β-ActinCaspase3/β-ActinControl0.198±0.0360.277±0.0210.105±0.008Art250μmol/L0.509±0.021**1.025±0.066**0.778±0.014** 3501.273±0.036**##1.148±0.017**##1.017±0.027**## 4501.750±0.063**##△△1.364±0.035**##△△1.462±0.048**##△△

Art: Artesunate

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsArt 250 μmol/L group;△△P<0.01vsArt 350 μmol/L group

3 討論

肝纖維化是多種因素參與的復(fù)雜病理過程，具有可逆性。肝星狀細胞的增殖與活化是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]。研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能有效抑制大鼠原代肝星狀細胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡，但其具體作用機制鮮見研究。神經(jīng)酰胺即N-脂酰鞘氨醇，作為脂質(zhì)第二信使其參與多種信號通路，可調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、凋亡及應(yīng)急反應(yīng)等，但有關(guān)神經(jīng)酰胺在肝纖維化中的作用卻鮮見報道。低分子量的神經(jīng)酰胺(如神經(jīng)酰胺C2)可透過細胞膜，所以測定細胞培養(yǎng)上清液中的神經(jīng)酰胺C2含量可以顯示出細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺的變化，本實驗采用高效液相法測定其含量，與對照組比較，不同濃度青蒿琥酯作用后LX-2培養(yǎng)上清中神經(jīng)酰胺C2的含量增加，同時隨著給藥濃度的增加抑制LX-2增殖的作用也增強。實驗結(jié)果表明青蒿琥酯可能是通過提高神經(jīng)酰胺含量而抑制肝星狀細胞的增殖。

過氧化物酶體增殖受體(PPAR-γ)是核受體家族成員之一，PPAR-γ 表達與HSC靜止表型的維持有一定的關(guān)系，如體外培養(yǎng)人HSC細胞，隨著HSC的激活，PPAR-γ 的表達顯著下降[9]。用腺病毒轉(zhuǎn)染PPAR-γ，結(jié)果PPAR-γ 能夠抑制HSC的增殖，同時抑制活化的HSC表達α-SMA、Ⅰ型膠原[10]。近年來研究證實神經(jīng)酰胺能抑制PPAR-γ 的表達，從而減少肝臟的脂肪病變[11]。神經(jīng)酰胺能增加人肝癌細胞中PPAR-γ 的轉(zhuǎn)錄活性，使細胞周期阻滯，從而抑制肝癌細胞生長[12]。然而在肝纖維化中，神經(jīng)酰胺對PPAR-γ 的潛在影響尚不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯能呈劑量依賴性地提高神經(jīng)酰胺的含量，同時也使PPAR-γ 表達呈劑量依賴性地增加，并且神經(jīng)酰胺和PPAR-γ 在對肝星狀細胞及肝癌細胞等增殖、活化的影響上有諸多類同，因此本研究結(jié)果初步探明了我們的設(shè)想青蒿琥酯可能通過干預(yù)神經(jīng)酰胺-PPAR-γ 通路抑制LX-2細胞增殖。課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可增加p53 mRNA和蛋白表達,從而影響細胞周期，使其阻滯在G1期,同時還可以促進肝星狀細胞凋亡[12]， 但其與神經(jīng)酰胺的關(guān)系并未指出，本研究中隨著青蒿琥酯濃度的升高，神經(jīng)酰胺含量增加，p53蛋白表達增加，凋亡執(zhí)行效應(yīng)分子Caspase 3激活,促進細胞凋亡。從而推測，青蒿琥酯可能是通過增加LX-2內(nèi)的神經(jīng)酰胺含量，促進肝星狀細胞凋亡，從而減少了羥脯氨酸的含量，使肝纖維化減弱。

綜上所述，青蒿琥酯能顯著增加肝星狀細胞LX-2內(nèi)神經(jīng)酰胺含量，提高PPAR-γ、p53及Caspase 3的表達，抑制LX-2細胞增殖，促進細胞凋亡。為青蒿琥酯抑制肝纖維化的作用及機制研究提供了一個新的思路，這一研究結(jié)果對肝纖維化的治療有重要意義。

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Effects of Artesunate on hepatic fibrosis and its mechanism

DU Yan, LI Li-nan, FANG Bu-wu△

(Department of Pharmacology, Basic Medical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China)

Objective: To investigate the effects of Artesunate(Art) on the LX-2 cell. Methods: The cultured hepatic stellate cells were divided into control group and Art-treated groups with 250,350,450 μmol/L. The rate of cellular proliferation was detected by MTT assay, the content of ceramide (Cer)was determined by HPLC method, the content of hydroxyproline (Hyp) was determined by enzyme digestion method, the expressions of PPAR-γ, p53 and Caspase 3 were detected by Western blot. Results: Compared with control group, LX-2 treated with Art were inhibited in a concentration-dependent manner(P<0.01). Art could significantly increase the content of ceramide in LX-2 (P<0.01), and the content of Hyp was significantly decreased (P<0.05,P<0.01). The expressions of PPAR-γ, p53 and Caspase 3 were increased compared with that of control group(P<0.01). Conclusion: Artesunate could inhibit the proliferation and induce apoptosis of hepatic stellate cells through upregulating ceramide.

Artesunate; hepatic fibrosis; ceramide; PPAR-γ; p53; Caspase 3

國家自然科學(xué)基金資助項目(30772856)

2014-10-15 【修回日期】2014-11-07

R337.2

A

1000-6834(2015)01-014-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.005

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