王媛婕,劉彥慧,廖瑞雪

(天津中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，天津 300193)

丹參酮ⅡA對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及機(jī)制研究

王媛婕,劉彥慧,廖瑞雪

(天津中醫(yī)藥大學(xué)護(hù)理學(xué)院，天津 300193)

丹參酮；缺血缺氧；腦損傷；新生大鼠；caspase-3；神經(jīng)細(xì)胞凋亡

新生兒缺血缺氧性腦損傷(hypoxia ischemic brain damage，HIBD)是引發(fā)新生兒死亡及神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因之一, 發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量。目前國(guó)內(nèi)外治療HIBD的主要方法為亞低溫治療[2]，但該法在降溫和復(fù)溫幅度、方式等方面差異較大，患兒在治療后死亡率仍高達(dá)50%，且伴嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)受損、心肺功能下降及肝腎損害[3]，因此，亞低溫療法存在較大的爭(zhēng)議和挑戰(zhàn)。目前其他單一措施也不能達(dá)到完全保護(hù)，治療HIBD的研究就顯得十分必要。

大量研究表明，丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)對(duì)腦、心、腎等臟器的缺血缺氧性損傷具有一定的保護(hù)作用[3-5]。本研究通過建立HIBD大鼠模型，檢測(cè)Tan ⅡA對(duì)新生大鼠HIBD后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及caspase-3蛋白表達(dá)的影響，探討了Tan ⅡA對(duì)新生大鼠HIBD的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的分子生物學(xué)機(jī)制，為新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(5 g·L-1)(批號(hào)：130528)；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、DAB檢測(cè)試劑盒(Roche, USA)；Western blot一抗(Abcam, UK);二抗：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；顯影劑：天津天陸感光材料廠；混合氣體：天津市賽米氣體有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備選7 d齡SPF級(jí)Wistar大鼠75只，許可證號(hào)：SCXK-(軍)2009-003，♀♂不限，體質(zhì)量12 g左右。每組15只,隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(HIBD)、高(0.08 mg·g-1,TH)、中(0.04 mg·g-1，TM)、低(0.008 mg·g-1，TL)劑量組。按Rice法[6]制備新生大鼠HIBD模型。10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)麻醉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，分離血管和神經(jīng)，結(jié)扎并縫合傷口。術(shù)后送回母鼠處2 h，然后將TH、TM、TL、HIBD新生鼠放入常壓缺氧艙(20×30×50 cm，密閉有機(jī)玻璃艙)，通入8%O2+92%CO2的混合氣體，流量2 L·min-1，持續(xù)2 h。Sham組僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎，不缺氧。當(dāng)缺血缺氧組的大鼠出現(xiàn)自發(fā)性左旋或夾尾左旋時(shí)，則模型建立成功。

按藥量/體重比計(jì)算給藥量，配成終體積0.2 mL的注射液。TH、TM、TL組均于缺血缺氧30 min后腹腔注射1次；Sham組和HIBD組則注射等量的生理鹽水。24 h后重復(fù)給藥一次。

1.3 樣品采集術(shù)后48 h迅速斷頭取腦，冰盤上取結(jié)扎側(cè)的海馬和大腦白質(zhì)，并等分為三份，取中間份置于4%甲醛溶液(PFA)中固定，另兩份置-80℃冰箱保存。

1.4 TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡取4%PFA固定的海馬組織，制石蠟切片；蛋白酶K(20 mg·L-1溶于Tris/HCl中，pH 7.6)室溫孵育30 min，PBS洗2次；加50 μL POD濕盒中37℃孵育30 min，PBS洗3次；加100 μL DAB于室溫孵育10 min，PBS洗3次；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，封片。光鏡下(20×, 10×)采集圖像并統(tǒng)計(jì)五個(gè)視野的細(xì)胞。凋亡率(apoptotic rate, AR)/%=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%。

1.5 Western blot法檢測(cè)腦組織caspase-3蛋白表達(dá)取低溫保存的大鼠大腦白質(zhì)組織100 mg，裂解，4℃研磨裂解30 min，3 000 r·min-1離心10 min，上清用BCA法測(cè)蛋白濃度，酶標(biāo)儀測(cè)相應(yīng)的蛋白含量，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用Image J軟件進(jìn)行圖象分析，蛋白表達(dá)水平用目的條帶與β-actin條帶灰度值(optical density，OD)之比的百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)凋亡細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析按Soslow法[7]。 Sham組僅見極少量TUNEL陽性細(xì)胞；與Sham組比較，HIBD組可見大量TUNEL陽性細(xì)胞(P<0.01)；與HIBD組比較，TH、TM及TL組缺血區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞均明顯減少(P<0.01)；而與TL比較，TH缺血區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞明顯減少(P<0.01)。見Tab 1。

GroupnARTL1124.00±3.317##TM1121.08±3.942##TH1319.55±2.697##Sham1513.00±3.606HIBD1243.33±4.041**

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsHIBD group. Due to the rapture of the carotid artery,2 rats were dead in TH group,2 in TM group,3 in TL group and 3 in HIBD group in the process of ischemia surgery. In the process of hypoxia,2 rats were dead in TM group and 1 in TL group due to intolerance of oxygen shortage.

2.2 腦組織中caspase-3蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果顯示：與Sham組比較，HIBD組caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與HIBD組比較，TL組、TM組及TH組caspase-3蛋白表達(dá)逐漸降低，且TH組明顯低于TL組(P<0.01)。見Tab 2。

GroupnCaspase-3ODCaspase-3/β-actinODTL110.99±0.071##34.04±2.387##TM110.83±0.059##29.27±2.005##TH130.80±0.069##28.13±2.275##Sham150.71±0.02124.69±1.693HIBD121.41±0.063**47.89±2.722**

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsHIBD group

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)HIBD組和給藥組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組，證實(shí)了缺血缺氧可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡發(fā)生。Tan ⅡA組的神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，說明Tan ⅡA有抑制HIBD所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。通過Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，給予Tan ⅡA后新生大鼠腦組織中caspase-3蛋白的表達(dá)明顯低于HIBD組，且呈一定的劑量效應(yīng)。說明Tan ⅡA可以通過抑制caspase-3的表達(dá)起到抗凋亡作用。

綜上所述，Tan ⅡA對(duì)新生大鼠HIBD具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能是基于Tan ⅡA對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制，也即通過降低caspase-3的表達(dá)水平來發(fā)揮Tan ⅡA的抗凋亡的作用，從而起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。在迄今對(duì)新生兒HIBD尚無確定的特效神經(jīng)保護(hù)手段的情況下，Tan ⅡA對(duì)新生大鼠HIBD神經(jīng)損傷的保護(hù)作用具有較大的研究?jī)r(jià)值和臨床意義。

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《中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)投稿與閱讀須知》刊登在每年第1期卷首。

Protective effect of tanshinone ⅡA on neurocyte apoptosis in rats with hypoxia ischemic brain damage and its mechanism

WANG Yuan-jie, LIU Yan-hui, LIAO Rui-xue

(SchoolofNursing,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193,China)

tanshinone; hypoxia ischemic; brain damage; neonatal rats; caspase-3; neurocyte apoptosis

時(shí)間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.030.html

2014-11-02,

2014-12-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30973935)

王媛婕(1989-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)病學(xué)，E-mail：yuanjie166@163.com； 劉彥慧(1971-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)病學(xué)，通訊作者，E-mail：yh_liu888@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.030

A

1001-1978(2015)03-0443-02

R-332；R284.1；R322.81；R329.25；R722.1；R743.31；R845.22