王 珊，高奕紅，高豐琴

(咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，712000)

血清白蛋白具有重要的生理功能，可與許多內(nèi)源、外源性化合物結(jié)合[1]，是藥物發(fā)揮藥效的重要載體和靶分子[2-4]。因此定量檢測(cè)血清蛋白質(zhì)在生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等方面具有重要的意義。目前,有LOWRY法[5]、凱氏定氮法[6]、BRADFORD法[7]、化學(xué)發(fā)光法[8]及電化學(xué)法[9]等方法,但存在準(zhǔn)確度或靈敏度不夠高,方法線性范圍窄、費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn)。作者以葉酸與牛血清白蛋白(BSA)相互作用時(shí)會(huì)引起B(yǎng)SA熒光淬滅為基礎(chǔ),固定BSA濃度，研究不同濃度葉酸存在下BSA的熒光光譜變化,進(jìn)而為建立一個(gè)操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、線性范圍寬的測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的新熒光光譜分析法提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

牛血清白蛋白：分析純，百靈威試劑公司；葉酸：分析純，鄭州天健生物技術(shù)有限公司；其它試劑均為市售分析純。

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)：美國(guó)PE公司；UV-Vis Specord50 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：德國(guó)耶拿公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器：南京超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 配制Tris-HCl緩沖溶液

(1) 先稱3.634 2 g三羥甲基氨基甲烷,用少量蒸餾水溶解，配成0.1 mol/L的Tris溶液。

(2) 稀釋定量的鹽酸至濃度為0.1 mol/L。

(3) 在天平上稱量氯化鈉固體1.2 g，然后加入41 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌使氯化鈉固體溶解，配制成濃度為0.5 mol/L的氯化鈉溶液。

(4) 量取250 mL，0.1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液于燒杯中，再加入210 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，加入適量的氯化鈉溶液，用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)混合溶液pH至7.40(用酸度計(jì)檢測(cè))，最后用蒸餾水加至刻度處,于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶液的配制

用電子分析天平準(zhǔn)確稱取0.667 g的牛血清白蛋白固體，注意在稱量紙上稱量。再加入一定量的蒸餾水，然后利用磁力攪拌器進(jìn)行粉碎溶解(溶解時(shí)不能加熱，也不可長(zhǎng)時(shí)間見(jiàn)光)，再定容到500 mL容量瓶中,得到濃度是1.0×10-6mol/L的牛血清白蛋白溶液。

取5片葉酸片，加入15 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的氨水溶液溶解(應(yīng)充分溶解，并且不能加熱)，再加入蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，并避光低溫保存在恒溫箱中.得到1.0×10-3mol/L FA溶液。

1.2.3 熒光光譜測(cè)定

在10 mL的比色管中加入3.0 mL BSA溶液，2.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、2.0 mL NaCl溶液溶液，稀釋至刻度，搖勻、靜置5 min。準(zhǔn)確移取3.0 mL該溶液于石英比色皿中，用微量進(jìn)樣器逐次加入葉酸溶液，得到葉酸濃度依次遞增的7組混合溶液，搖勻靜止10 min，測(cè)定熒光發(fā)射光譜。

1.2.4 同步熒光測(cè)定

由于牛血清白蛋白中的3種有熒光特性的芳香族氨基酸的熒光光譜發(fā)射峰在一定條件下重疊較大,常規(guī)熒光掃描光譜難以把它們的特征光譜區(qū)分,所以采用同步熒光光譜掃描，并以此發(fā)射波長(zhǎng)的改變情況判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。保持BSA濃度不變，每次加入10 μL的葉酸溶液，調(diào)節(jié)發(fā)射波長(zhǎng)與激發(fā)波長(zhǎng)的Δλ=60 nm和Δλ=15 nm，并記錄300～450 nm的同步熒光光譜。

1.2.5 紫外光譜測(cè)定

利用SPECORD 50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，以BSA溶液作為參比，將不同濃度的葉酸加入到BSA溶液中，每次加完溶液,充分混合20 min，在波長(zhǎng)200～550 nm進(jìn)行紫外測(cè)定，并記錄各個(gè)濃度的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.6 金屬離子對(duì)反應(yīng)的影響

生命體中含有微量的金屬離子,當(dāng)小分子物質(zhì)與牛血清白蛋白作用結(jié)合時(shí),金屬離子會(huì)對(duì)作用結(jié)果產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)研究加入Mg2+、Cu2+、Ca2+和Zn2+等離子后對(duì)葉酸與BSA結(jié)合反應(yīng)的影響變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛血清白蛋白與葉酸相互作用紫外光譜研究

FA與BSA作用的紫外光譜見(jiàn)圖1，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7為c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。由圖1可知,加入葉酸后牛血清白蛋白的紫外光譜的峰形基本沒(méi)發(fā)生變化,在280 nm附近的吸收峰強(qiáng)度明顯變化，說(shuō)明葉酸使蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變。葉酸濃度較低時(shí),葉酸與牛血清白蛋白結(jié)合有利于蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象改變；當(dāng)葉酸的濃度進(jìn)一步升高時(shí),葉酸分子誘導(dǎo)蛋白分子發(fā)生蛋白質(zhì)二級(jí)，三級(jí)結(jié)構(gòu)迅速改變。

λ/nm圖1 FA與BSA作用的紫外光譜

2.2 牛血清白蛋白與葉酸相互作用的熒光光譜分析

蛋白質(zhì)中的熒光主要來(lái)自色氨酸殘基和酪氨酸殘基，而熒光變化直接反映出蛋白質(zhì)中色氨酸殘基本身和周圍的變化。以激發(fā)波長(zhǎng)280 nm時(shí)，在350 nm附近出現(xiàn)熒光光譜的最大發(fā)射波長(zhǎng)。研究牛血清白蛋白的熒光光譜隨葉酸濃度增大而變化的情況，見(jiàn)圖2，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7為c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BSA的濃度一定時(shí)，隨著葉酸的濃度緩慢增加，BSA的內(nèi)源熒光會(huì)發(fā)生有規(guī)律的猝滅，即說(shuō)明它們發(fā)生了相互作用，但牛血清白蛋白的最大發(fā)射波長(zhǎng)(λem=350 nm)保持不變，發(fā)生了熒光的淬滅。

λ/nm圖2 298 K時(shí)FA與BSA作用的熒光光譜

2.3 熒光猝滅機(jī)理

蛋白質(zhì)熒光猝滅機(jī)理主要分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。根據(jù)Stern-Volmer 方程得：

F0/F=1+KSV[Q]=1+Kqτ0[Q]

(1)

式中：F0和F分別為未加小分子和加入小分子以后的熒光強(qiáng)度；Kq為動(dòng)態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)；Ksv代表Stern-Volmer猝滅常數(shù)，Ksv值越大,則說(shuō)明小分子與BSA 間的相互作用越強(qiáng)；[Q]代表小分子的濃度；τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下測(cè)得的熒光壽命(τ0≈10-8s)。

能發(fā)生猝滅的小分子對(duì)生物大分子蛋白質(zhì)的最大擴(kuò)散速率常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)。設(shè)FA對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程為動(dòng)態(tài)猝滅,則作出298 K下葉酸對(duì)BSA熒光猝滅的Stem-Volmer 曲線,見(jiàn)圖3，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；c(FA)=2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。由直線的斜率可求出KSV=9.25×104L/mol,進(jìn)一步求得Kq=9.25×1012L/(moL·s)。遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅小分子對(duì)生物大分子蛋白質(zhì)的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)2×1010L/(moL·s),即說(shuō)明FA對(duì)BSA的熒光猝滅是靜態(tài)猝滅而非動(dòng)態(tài)猝滅。

c/10-5 mol/L圖3 FA與BSA作用的Stem-Volmer曲線

2.4 FA與BSA的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

假設(shè)FA在BSA上有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn),由表達(dá)式：

lg[(F0-F) /F]=lgK0+nlg[Q]

(2)

則以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgcq作圖,見(jiàn)圖4，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/L，其線性方程的斜率和截距分別為結(jié)合點(diǎn)位數(shù)n和lgK0，即結(jié)合點(diǎn)位數(shù)n=0.981,結(jié)合常數(shù)K0=9.98×103L/mol，說(shuō)明二者相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可能是1個(gè)，結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級(jí)在104L/mol以上。

lgcq圖4 FA與BSA作用的雙對(duì)數(shù)曲線

2.5 同步熒光研究

FA與BSA的同步熒光光譜見(jiàn)圖5，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L；1～7為c(FA)=0、2×10-6、4×10-6、6×10-6、8×10-6、10×10-6、12×10-6mol/ L。同步熒光光譜中最大波長(zhǎng)發(fā)生極小藍(lán)移，即BSA分子內(nèi)色氨酸殘基和絡(luò)氨酸殘基由于小分子葉酸的加入而所處微環(huán)境發(fā)生改變，色氨酸殘基和酪氨酸殘基疏水環(huán)境增強(qiáng),表明BSA的分子構(gòu)象發(fā)生改變。且隨著葉酸的依次加入,峰強(qiáng)度逐漸減弱。

λ/nm圖5 FA與BSA作用的同步熒光光譜圖

2.6 金屬離子對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

金屬離子溶液的加入影響了藥物分子和BSA的結(jié)合，見(jiàn)圖6，其中c(BSA)=1.0×10-6mol/L,c(FA)=c(Ca2+)=c(Cu2+)=c(Zn2+)=c(Mg2+)=1.0×10-5mol/L, 1為BSA+10 μL FA (Mg2+)，2為BSA+10 μL FA+ Zn2+，3為BSA+10 μL FA + Ca2+，4為BSA+10 μL FA+ Cu2+。由圖6可知，Cu2+、Ca2+和Zn2+的加入使得BSA的內(nèi)源熒光也發(fā)生猝滅，Mg2+無(wú)影響。

λ/nm圖6 金屬離子對(duì)FA與BSA影響作用的熒光光譜圖

3 結(jié) 論

牛血清白蛋白與葉酸藥物分子發(fā)生了較強(qiáng)的相互作用,葉酸可以使牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)生有規(guī)律的猝滅,且該熒光猝滅過(guò)程是一個(gè)靜態(tài)猝滅過(guò)程。并且通過(guò)參數(shù)計(jì)算表明，F(xiàn)A與BSA的結(jié)合常數(shù)在104L/mol數(shù)量級(jí)以上,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可能為1個(gè)。金屬離子溶液的加入可影響藥物分子和BSA的結(jié)合，Cu2+、Ca2+和Zn2+的加入使得BSA的內(nèi)源熒光也發(fā)生猝滅，Mg2+無(wú)影響。該方法對(duì)建立蛋白質(zhì)分析方法研究具有重要的意義。

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