陳夕軍, 朱鍵鑫, 陳 羽, 張 青,2, 張家豪, 張孝然, 黃奔立

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇蘇州 215155）

抗白粉病黃瓜品種的葉片組織結(jié)構(gòu)及其生理生化

陳夕軍1, 朱鍵鑫1, 陳 羽1, 張 青1,2, 張家豪1, 張孝然1, 黃奔立1

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,江蘇蘇州 215155）

為明確不同黃瓜品種對(duì)白粉病的抗性機(jī)制,采用組織切片和田間接種的方法,從近130份種質(zhì)中篩選出高抗(GY14A、GY4）、中抗(津春4號(hào)、津優(yōu)30號(hào)）、中感(W12757、儀黃）、高感(DE843、平望乳瓜）黃瓜品種各2份,并對(duì)8份黃瓜品種的形態(tài)結(jié)構(gòu)與抗性生理生化進(jìn)行研究。結(jié)果表明,高抗品種葉片組織結(jié)構(gòu)緊湊,柵欄組織排列整齊、緊密,且細(xì)胞壁較厚；而高感品種則細(xì)胞壁較薄,葉片組織間出現(xiàn)大量空隙；中抗和中感品種雖具清晰的柵欄組織,但空隙較大,說明葉片組織細(xì)胞的排列整齊和緊密度以及細(xì)胞壁的厚度與黃瓜品種對(duì)白粉病的抗性密切相關(guān)。病原菌接種后,抗性品種體內(nèi)防御酶活性上升速度與幅度都明顯高于感病品種,且過氧化物酶(POD）同功酶譜帶較深,H2O2積累較慢。另外,抗性品種葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于感病品種,而可溶性糖含量則明顯低于感病品種,還原糖含量無明顯差異。

組織結(jié)構(gòu)；生理生化機(jī)制；白粉?。豢共⌒?；黃瓜

近年來,隨著保護(hù)地蔬菜種植面積的不斷擴(kuò)大,病害亦日趨嚴(yán)重。黃瓜白粉病是保護(hù)地蔬菜的重要病害之一,一般年份造成損失10%～20%,重病年可達(dá)50%以上,嚴(yán)重影響了黃瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)[1]。篩選與培育抗性品種是防治黃瓜白粉病最經(jīng)濟(jì)有效的手段,因此研究黃瓜抗病機(jī)制并在生產(chǎn)上加以應(yīng)用,就顯得尤為迫切。

植物的抗病性與其形態(tài)結(jié)構(gòu)密切相關(guān),表皮毛數(shù)量、蠟質(zhì)層和角質(zhì)層厚度、表皮細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)(木栓化、木質(zhì)化、鈣化和硅化程度）,以及氣孔、水孔和皮孔等自然孔口的形狀、大小和位置等,都會(huì)影響到寄主植物的抗病性[2-5]。而植物表皮組織排列的整齊度、緊密性和層數(shù)對(duì)病菌的侵入和擴(kuò)展亦可產(chǎn)生重要影響[3]。

植物體內(nèi)除本身存在的抗菌物質(zhì),如酚類、皂角苷、不飽和內(nèi)酯、芥子油、有機(jī)硫化物和糖苷類化合物外,常為抵抗病原物侵染等逆境而產(chǎn)生其他一些抗菌物質(zhì),如過氧化氫[6-7]、抗壞血酸[8-9]以及防御酶[6,10],這些物質(zhì)對(duì)于作物對(duì)病原物的抗性起重要作用,特別是防御酶類。苯丙氨酸解氨酶與植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的合成相關(guān)；多酚氧化酶則可將酚氧化成醌,這些醌類物質(zhì)對(duì)病原菌具有很強(qiáng)的毒性,亦可作為植保素合成的前體,參與植物對(duì)病原菌的生理和物質(zhì)防御[11]；而過氧化物酶則催化過氧化氫與多種有機(jī)或無機(jī)氫供體發(fā)生氧化還原反應(yīng)；超氧化物歧化酶作為重要的防御酶類,可清除寄主體內(nèi)過多的氧自由基,保護(hù)膜系統(tǒng)。本研究擬通過比較不同抗感白粉病黃瓜品種組織結(jié)構(gòu)與相關(guān)抗性物質(zhì)的差異,初步探明黃瓜抗白粉病機(jī)制,為建立該病的綜合防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜種質(zhì)：GY14A、GY4,高抗；津優(yōu)30號(hào)、津春4號(hào),中抗；WI2757、儀黃,中感；平望乳瓜、DE843,高感[12-13]。以上種質(zhì)均由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院陳學(xué)好博士提供。黃瓜種子浸種、催芽后,播于塑料穴盤的伯爵泥炭-2育苗基質(zhì)中,2片真葉后移栽至盆缽中備用。

供試菌源：黃瓜白粉病菌采自揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)基地大棚黃瓜病葉,經(jīng)鑒定確認(rèn)后,于黃瓜感病品種上擴(kuò)繁備用。

1.2 黃瓜抗白粉病鑒定[14]

將于感病黃瓜品種上擴(kuò)繁的白粉病菌孢子用毛筆輕輕刷入無菌水中,并向其中加入少許吐溫-20,配成1 ml 1×106個(gè)孢子的孢子液。將孢子液均勻噴施于第2片真葉完全展開的黃瓜幼苗葉片上,清水作空白對(duì)照,每處理10株,3次重復(fù)。10 d后調(diào)查病株率及病級(jí),計(jì)算病情指數(shù)。病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下： 0級(jí),無病斑；1級(jí),病斑占葉面積的1/5以下,白粉模糊不清；2級(jí),病斑占葉面積1/5～1/3,白粉較為明顯；3級(jí),病斑占葉面積1/3～1/2,白粉層較厚、連片；4級(jí),病斑占葉面積1/2～2/3,白粉層濃厚,葉片開始變黃、壞死；5級(jí),病斑占葉面積2/3以上,葉片枯黃。

1.3 組織切片制作

參照方中達(dá)的方法[15],略有改動(dòng)。取黃瓜5～6葉期葉片,切成3 mm×3 mm方塊,FAA固定液固定,鐵礬液媒染2 h,再以蘇木精預(yù)染2 h。分別以10%、30%、50%、70%、85%、95%和無水乙醇(3次）遞度脫水,每級(jí)停留20～30 min。再以無水乙醇∶二甲苯3∶1液、無水乙醇∶二甲苯1∶1液、無水乙醇∶二甲苯1∶3液和二甲苯(3次）依次透明處理,每次處理20 min。透明處理后的材料于二甲苯∶石蠟1∶1溶液中浸蠟,65℃烘箱中1 h；烘箱溫度調(diào)為60℃,并向其中加入純石蠟3次,每次間隔1 h。將浸蠟瓶從烘箱中取出后迅速倒入包埋盒中,材料置于盒底,整個(gè)包埋盒移至冷水中冷卻,完成包埋。對(duì)包埋有材料的蠟塊進(jìn)行修塊和切片,并將切片輕放于涂有薄層蛋白質(zhì)甘油和蒸餾水的玻片上,60℃烤片30 min,用濾紙吸除多余的水分。先用二甲苯和乙醇溶液脫蠟,再以伊紅染色,最后在材料中央滴加適量樹膠,以脫脂蓋玻片封片,形成永久玻片,顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)。

1.4 防御酶活性測(cè)定

將1 ml 1×106個(gè)孢子的孢子液均勻噴施于5～6片真葉的黃瓜植株上,分別于接種前、接種后1 d、3 d、5 d和7 d取倒2至倒3葉片進(jìn)行相關(guān)防御酶活性測(cè)定,每處理3次重復(fù)。苯丙氨酸解胺酶(PAL）、多酚氧化酶(PPO）和過氧化物酶(POD）等活性測(cè)定參照孔凡明等的方法[16]進(jìn)行,超氧化物歧化酶(SOD）活性測(cè)定參照鄒琦的方法[17]進(jìn)行。

1.5 糖含量測(cè)定

可溶性糖含量測(cè)定參照張妙霞等的蒽酮-稀硫酸法[18]。以葡萄糖繪制可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,糖含量計(jì)算公式為：可溶性糖含量(%）=[C×(V/a）×n]/ (W×106）,式中,C為標(biāo)準(zhǔn)方程求得的糖質(zhì)量(μg）,a為吸取的樣品液體積(ml）,V為提取液體積(ml）,n為稀釋倍數(shù),W為組織質(zhì)量(g）。

還原糖含量測(cè)定參照袁曉華等的3,5-二硝基水楊酸比色法[19]。以葡萄糖繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,糖含量計(jì)算公式為：還原糖含量(%）=[C×(V/a）]/(W×10）,式中,C為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得的還原糖質(zhì)量(mg）,V為提取液體積(ml）,a為顯色時(shí)吸取的樣品液體積(ml）,W為樣品質(zhì)量(g）。

1.6 可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定

參照鄒琦的方法[17]。取接種后葉片0.5 g,剪碎后加入5 ml蒸餾水研磨,勻漿后于4 000 r/min下離心10 min。取上清1.0 ml于具塞試管中,加入5 ml考馬斯亮藍(lán)G-250溶液充分混勻。放置2 min后,于595 nm下讀取吸光值。以牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中可溶性蛋白質(zhì)含量(mg/g）=(C×VT）/(V1×FW×1 000）,式中,C為查得的標(biāo)準(zhǔn)曲線值(μg）,VT為提取液總體積(ml）,V1為測(cè)定時(shí)加樣量(ml）,FW為樣品鮮質(zhì)量(g）。

1.7 木質(zhì)素含量的測(cè)定

參照波欽諾克的方法[20]。以淀粉作指示劑,以0.1 mol/L Na2S2O3溶液為滴定液,滴定至溶液變?yōu)樗{(lán)綠色為止(滴定終點(diǎn)）。木質(zhì)素含量(%）= [0.043×K×(a-b）]/FW,K為Na2S2O3的濃度,FW為樣品鮮質(zhì)量(g）,a為滴定對(duì)照液所用Na2S2O3體積(ml）,b為滴定樣品液所用Na2S2O3體積(ml）。

1.8 過氧化氫含量的測(cè)定

參照鄒琦的方法[17]。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的比色波長(zhǎng)為415 nm,光徑1 cm。過氧化氫含量(μmol/g）=(C×VT）/(FW×V1）,C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的H2O2量(μmol）,VT為樣品提取液總體積(ml）,V1為測(cè)定時(shí)所用樣品提取液體積(ml）,FW為植物組織鮮質(zhì)量(g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同黃瓜品種對(duì)白粉病的抗性

對(duì)高抗、中抗、中感和高感白粉病品種各2個(gè)再次進(jìn)行溫室鑒定,結(jié)果表明各品種抗性差異明顯,其中GY14A和GY4完全抗病,而DE843的病株率和病情指數(shù)則分別為40.33%和6.82,平望乳瓜的病株率和病情指數(shù)分別為46.73%和7.14(表1）。

表1 黃瓜不同抗性品種的病株率與病情指數(shù)Table 1 Incidences and disease indexes of cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew

2.2 不同抗性黃瓜品種的葉片組織結(jié)構(gòu)差異

從圖1可以看出,高抗品種的組織結(jié)構(gòu)緊湊,細(xì)胞壁較厚,柵欄組織排列整齊、緊密,海綿組織緊貼柵欄組織,且都較清晰；而高感品種的葉片組織出現(xiàn)大量空隙,較難見到完整細(xì)胞,細(xì)胞壁較薄,柵欄組織排列稀松,與海綿組織之間也沒有明顯界限,表皮細(xì)胞層也遠(yuǎn)薄于其他品種；中抗品種的細(xì)胞壁要薄于高抗品種,柵欄組織雖不及高抗品種緊密,但要遠(yuǎn)好于平望乳瓜等高感品種；中感品種雖能見到清晰的柵欄組織,但空隙仍較大。由此可見,葉片組織細(xì)胞排列整齊、緊密,細(xì)胞壁較厚可能是黃瓜抗白粉病的主要原因之一。

圖1 不同抗性黃瓜品種葉片組織顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructures of the leaves of cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew

2.3 不同抗性黃瓜品種接種前后防御酶活性的變化

接種前后各品種防御酶活性的變化見圖2。接種前,各品種苯丙氨酸解胺酶(PAL）活性差異不大；接種后,高抗品種GY14A和GY4的PAL活性明顯上升,1 d后達(dá)最大值；而中抗品種的出峰時(shí)間明顯滯后,接種后3 d活性才達(dá)最大值；感病品種PAL活性在接種后明顯下降。接種前,各品種體內(nèi)過氧化物酶(POD）活性較低,且與品種抗性表現(xiàn)無相關(guān)性；接種后,抗性品種體內(nèi)POD活性及上升幅度明顯高于感病品種,且維持時(shí)間較長(zhǎng)。接種前,以抗性品種體內(nèi)多酚氧化酶(PPO）活性較高；接種后,亦以抗性品種體內(nèi)PPO的上升幅度較大,并在接種后1 d達(dá)最大值；感病品種在接種前后PPO活性的變化并無明顯的規(guī)律。接種前抗性品種體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD）活性明顯低于感病品種；接種后抗性品種體內(nèi)SOD活性急劇上升,且一直維持在較高水平；而感病品種SOD活性卻在接種后急劇下降,直至第5 d才回復(fù)到原來水平。由此可見,幾種防御酶在接種白粉病菌的抗性黃瓜品種體內(nèi)都可被強(qiáng)烈誘導(dǎo),而在感病品種中表現(xiàn)并不一致,說明防御酶與品種抗性有顯著相關(guān)性。

2.4 不同抗性黃瓜品種接種前后糖含量的變化

可溶性糖含量測(cè)定結(jié)果表明,抗病黃瓜品種中可溶性糖含量明顯低于感病品種。接種后,抗病品種中可溶性糖含量出現(xiàn)緩慢下降；而感病品種中,則出現(xiàn)明顯的短暫上升,并分別于第1至第3 d達(dá)最大值,然后急劇下降(圖3）。還原糖含量在抗感白粉病黃瓜品種中并無明顯差異,均呈波浪性起伏。由此可見,抗性品種在接種白粉病菌后,可通過降低體內(nèi)可溶性糖含量來提高自身對(duì)病原物的抗性。

2.5 不同抗性黃瓜品種接種前后可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

不同抗性品種在接種前,其體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量無明顯差異。接種1 d后,高抗品種中可溶性蛋白質(zhì)含量急劇上升,然后又急劇下降,第3 d時(shí)與其他品種已基本無差異(圖4）。說明,抗性品種可通過短時(shí)間里提高自身可溶性蛋白質(zhì)含量來提高對(duì)病原物的抗性。

2.6 不同抗性黃瓜品種接種前后木質(zhì)素含量的變化

較高的木質(zhì)素含量是抗病品種的基本特征。接種前,抗性品種體內(nèi)的木質(zhì)素含量明顯高于感病品種；接種后,所有品種中木質(zhì)素含量都有所增加,且抗感品種趨勢(shì)一致,但感病品種木質(zhì)素含量總體低于抗病品種(圖5）。

2.7 不同抗性黃瓜品種接種前后過氧化氫含量的變化

接種前,抗感品種體內(nèi)過氧化氫含量雖有不同,但差異較?。唤臃N后,各品種體內(nèi)過氧化氫含量都有一短期(3 d）內(nèi)上升的過程,但以感病品種上升幅度較大,而抗性品種增幅平緩(圖6）。

圖2 不同抗性黃瓜品種接種后體內(nèi)防御酶活性變化Fig.2 Changes of defense enzymes activities in cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew after inoculation

圖3 不同抗性黃瓜品種接種后體內(nèi)糖含量變化Fig.3 Changes of sugar contents in cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew after inoculation

3 討論

植物體形態(tài)結(jié)構(gòu)常與其對(duì)逆境的適應(yīng)性有關(guān)。不同生境下,熱帶植物對(duì)木質(zhì)部腔化的抗性與其莖葉的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[21]。高抗梨黑星病的早金香梨葉片柵欄組織為2層、較厚,且海綿組織致密,表面蠟質(zhì)也較厚；而感病品種則僅有一層?xùn)艡诮M織,且較薄,海綿組織疏松[22]。大豆抗灰斑病品種葉片亦表現(xiàn)柵欄組織排列整齊、緊密、層數(shù)較多等抗性結(jié)構(gòu)特征,感病品種則表現(xiàn)柵欄組織層數(shù)少、排列疏松等易感特征[3]。本研究結(jié)果表明,在黃瓜抗白粉病品種中,其柵欄組織排列整齊、緊密,且細(xì)胞壁較感病品種明顯偏厚。感病品種中,葉片組織間出現(xiàn)大量空隙,柵欄組織與海綿組織間分界模糊,表皮層較薄。這些結(jié)果說明,黃瓜葉片的組織結(jié)構(gòu)與其對(duì)白粉病的抗性密切相關(guān)。

圖4 不同抗性黃瓜品種接種后體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量變化Fig.4 Changes of soluble protein contents in cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew after inoculation

圖5 不同抗性黃瓜品種接種后體內(nèi)木質(zhì)素含量變化Fig.5 Changes of lignin contents in cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew after inoculation

圖6 不同抗性黃瓜品種接種后體內(nèi)過氧化氫含量變化Fig.6 Changes of H2O2contents in cucumber cultivars with different resistances to powdery mildew after inoculation

大量研究結(jié)果表明,寄主對(duì)病原物的抗性亦與其體內(nèi)的防御酶和一些次生代謝物質(zhì)有關(guān)。寄主在受到外界生物或非生物因素誘導(dǎo)后,為抵抗病原物侵染或逆境的影響,體內(nèi)防御酶活性和次生代謝物含量會(huì)發(fā)生明顯變化[23-24]。如核黃素可及時(shí)誘導(dǎo)甜菜體內(nèi)過氧化氫的產(chǎn)生和酚類物質(zhì)的積累,同時(shí)上調(diào)其PAL和cprx1基因的表達(dá)[25]；含氮雜環(huán)類化合物可誘導(dǎo)黃瓜體內(nèi)防御酶的活性大大提高,從而增強(qiáng)其對(duì)白粉病的抗性[10]。另外,PAL是連接植物初級(jí)代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的酶,PAL活性的提高可使苯丙烷類物質(zhì)更高效地轉(zhuǎn)化而形成木質(zhì)素、類黃酮等物質(zhì),提高植物的抗病性。本研究結(jié)果表明,接種病原菌后,黃瓜抗感白粉病品種中防御酶活性變化并不一致,抗性品種在接種后短期內(nèi)酶活上升明顯,而且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)；而感病品種的酶活性上升有滯后現(xiàn)象,且上升幅度較小。這也進(jìn)一步說明,抗白粉病黃瓜品種在清除體內(nèi)氧自由基以及合成與抵抗病菌侵入的次生代謝物方面,能力要高于感病品種。

有關(guān)植株體內(nèi)糖含量與其抗病性的關(guān)系研究結(jié)果并不一致。龍書生等[26]認(rèn)為,玉米莖稈內(nèi)的可溶性糖、還原糖和總糖的量與植株的抗性呈顯著正相關(guān),糖分含量的高低可作為其抗鐮刀菌莖腐病的育種指標(biāo)。而云興福[27]則認(rèn)為,黃瓜子葉和同一植株不同葉位真葉內(nèi)可溶性糖含量與其對(duì)霜霉病的抗性呈高度正相關(guān)；還原糖含量及還原糖與總糖比則與抗病性呈高度負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),黃瓜抗白粉病品種中可溶性糖含量明顯低于感病品種,且在接種病原菌后,其含量有下降趨勢(shì)；而感病品種中卻有短時(shí)上升現(xiàn)象。而且,還原糖含量在抗、感白粉病黃瓜品種中并無明顯變化規(guī)律。同樣,不同植物被不同病原菌侵染后,其體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量變化亦并不相同[28-29]。這是由于糖和可溶性蛋白質(zhì)含量本就與植物對(duì)病原菌抗性無關(guān),還是由于寄主對(duì)不同病原菌表現(xiàn)抗性的機(jī)理不同,有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯：張震林）

Physiological and biochemical mechanism of cucumber cultivars resistant to powdery mildew and their differences in microstructure of leaves

CHEN Xi-jun1, ZHU Jian-xin1, CHEN Yu1, ZHANG Qing1,2, ZHANG Jia-hao1, ZHANG Xiao-ran1, HUANG Ben-li1

(1.College of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China；2.Suzhou Academy of Agricultural Sciences,Suzhou 215155,China）

To define the resistance mechanism of cucumber to powdery mildew,eight cucumber cultivars,selected from near 130 cultivars with different resistance levels to powdery mildew,were involved to research the differences of microstructures and physiological and biochemical indexes.Cucumber cultivars GY14A and GY4 are highly resistant,Jinchun No.4 and Jinyou No.30 are moderately resistant,W12737 and Yihuang are moderately susceptible,and DE843 and Pingwangrugua are highly susceptible.The highly resistant cultivars showed arranged palisade tissues thick cell walls while the highly susceptible cultivars exhibited thin cell walls and a great number of interspaces among cells.The palisade tissues were clearly seen in moderately resistant and susceptible cultivars,however,with large interspaces among the cells.The results indicated that the resistance levels of cucumber cultivars were associated with the arrangement and compactness of leaf cells and the thickness of their cell walls.After inoculation withSphaerotheca fuliginea,the increases of defense enzymes activities of resistant cultivars were greater than those of susceptible cultivars.ThebandsofPODisozymes of resistant cultivars were much darker,and the accumulations of H2O2were slower.In addition,the contents of soluble proteins in the resistant cultivarswere higher than those in the susceptible cultivars while the soluble sugar contents were lower.The reducing sugar contents had no obvious difference.

tissue structure；physiological and biochemical mechanism；powdery mildew；resistance；cucumber

S436.421.1+2

A

1000-4440(2015）01-0055-07

陳夕軍,朱鍵鑫,陳 羽,等.抗白粉病黃瓜品種的葉片組織結(jié)構(gòu)及其生理生化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(1）：55-61.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.008

2014-07-07

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(12）3019]；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2010305）

陳夕軍(1973-）,男,江蘇阜寧人,博士,副教授,專業(yè)方向?yàn)橹参锊『捌浞揽亍?E-mail）xjchen@yzu.edu.cn

黃奔立,(E-mail）yzhbl2003@163.com；張 青,(E-mail） zhangqingsz@163.com