毛 立, 劉 霞,, 李文良, 楊蕾蕾, 張紋紋, 魏建忠, 江杰元

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇南京 210014；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036）

邊界病病毒E2蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立

毛 立1, 劉 霞1,2, 李文良1, 楊蕾蕾1, 張紋紋1, 魏建忠2, 江杰元1

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,江蘇南京 210014；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036）

邊界病病毒(Border disease virus,BDV）是導(dǎo)致綿羊和山羊繁殖障礙的重要病原。為了建立檢測BDV特異抗體的ELISA方法,本研究將BDV基因克隆入原核表達(dá)載體pET-32a(+）,并構(gòu)建重組表達(dá)菌,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白質(zhì)。以純化的重組表達(dá)蛋白質(zhì)為抗原,建立間接ELISA(rE2-ELISA）檢測方法。通過反應(yīng)條件優(yōu)化,確定抗原包被濃度4.0 μg/ml；封閉液為20 g/L BSA；血清最佳稀釋度為1∶50,孵育1 h；二抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶30 000,作用45 min；以TMB為底物顯色10 min。用該ELISA方法檢測瘟病毒屬的CSFV、BVDV陽性血清,結(jié)果均為陰性。對187份山羊血清樣品進(jìn)行臨床檢測,與Svanova試劑盒檢測結(jié)果陽性符合率為76.25%,總符合率為74.87%；上述檢測方法同時(shí)與Western blot鑒定結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,Western blot結(jié)果與rE2-ELISA檢測結(jié)果的符合率為79.55%,高于與Svanova試劑盒檢測的符合率(72.73%）。表明建立的間接ELISA檢測方法可適用于臨床BDV血清樣品的抗體檢測。

邊界病病毒；E2蛋白質(zhì)；間接ELISA

瘟病毒屬病毒在反芻獸和豬等家畜中能引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,如今,黃病毒科瘟病毒屬病毒包括4個(gè)種,其中感染反芻動(dòng)物的3個(gè),牛病毒性腹瀉病毒1型(Bovine viral dirrhoea virus type 1,BVDV-1）, BVDV-2和邊界病病毒(Border disease virus, BDV）[1]。而瘟病毒屬為RNA病毒,其高突變率導(dǎo)致新的病毒種不斷出現(xiàn),除了現(xiàn)有的4種病毒外,還新發(fā)現(xiàn)了Giraffe病毒、Pronghorn病毒、Bungowannah病毒和HoBi樣瘟病毒,但是這些新病毒種尚未被正式承認(rèn)[2-3]。

邊界病是由BDV引起的綿羊和山羊的一種先天性病毒病,臨床感染可表現(xiàn)出多種癥狀,如母羊不孕、流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等繁殖障礙疾病；羔羊畸形發(fā)育、全身骨骼肌震顫等神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及持續(xù)性感染(Persistently infected,PI）。PI動(dòng)物常見于綿羊,少見于山羊,是羊群中BDV的主要傳染源。自1959年首次發(fā)現(xiàn)該病以來,英格蘭、蘇格蘭、瑞士、美國、日本、澳大利亞、加拿大等許多養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的國家均有關(guān)于本病的報(bào)道。近年來,意大利、土耳其、突尼斯等地相繼報(bào)道了BDV感染野生小反芻動(dòng)物的病例,并分離出相應(yīng)病原[4]。BDV可以跨越宿主屏障,感染家畜以及多種野生小反芻動(dòng)物,給世界經(jīng)濟(jì)帶來了十分重大的經(jīng)濟(jì)損失。而在中國,直到2013年才首次從華東地區(qū)的腹瀉山羊中分離到BDV,證明了邊界病在中國的存在[5]。

BDV基因組為單股正鏈RNA,長約12 300 bp,含有一個(gè)大的開放閱讀框(ORF）,兩端分別為5′端非編碼區(qū)(5′-UTR）和3′端非編碼區(qū)(3′-UTR）。ORF編碼一段大小約為3 900 bp的多肽蛋白質(zhì),在宿主和病毒蛋白酶的作用下,水解為12個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。其中囊膜糖蛋白質(zhì)E2是BDV的免疫優(yōu)勢蛋白質(zhì),能夠誘發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對BDV的中和抗體,繼而抵抗病毒的感染。目前,國內(nèi)針對BDV感染的發(fā)生,大多數(shù)是通過PCR檢測方法進(jìn)行病原鑒定,尚無簡便快捷的診斷方法。因而,針對E2蛋白質(zhì)作為建立血清學(xué)診斷方法和研制新型活載體疫苗亞單位疫苗的候選抗原,建立快速有效的檢測方法對于BDV的快速診斷具有重要意義[6]。

本研究通過擴(kuò)增BDV JSLS12-01分離株的E2抗原區(qū),克隆入pET32a(+）,構(gòu)建重組大腸埃希菌,將目的蛋白質(zhì)純化后建立了檢測BDV IgG抗體的間接ELISA方法。該檢測方法特異、敏感、重復(fù)性較好,臨床樣品檢測證實(shí)該方法可初步用于流行病學(xué)調(diào)查和抗體監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-32a(+）載體由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存；Trizol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌DH5α、BL21感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG、兔抗山羊IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；BDV抗體檢測試劑盒購自瑞典Svanova公司；進(jìn)口分析純His標(biāo)簽單抗和其他常規(guī)試劑購自Abmart公司。待檢血清采集自江蘇、安徽等地羊場。

1.2 方法

1.2.1 基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)BDV JSLS12-01株基因序列(KC963426）,比較基因序列的抗原性、疏水性等特征,選擇抗原性高的區(qū)域,設(shè)計(jì)引物。上、下游引物各引入BamHⅠ和XhoⅠ位點(diǎn),擴(kuò)增基因中的基因片段。引物序列如下,F：5′-CGGGATCCTGTC-CTTGTGATTCCAAGCC-3′；R：5′-CCCTCGAGCTAAGCTATCTCTAGGTTCATA-3′；以上引物由南京思普金生物科技有限公司合成。

根據(jù)Trizol試劑說明書,提取BDV JSLS12-01細(xì)胞毒的RNA,溶于無RNase水中。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Easyscript one-step RT-PCR SuperMix進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μl,反應(yīng)程序：45℃50 min；94℃5 min；94℃30 s,56℃30 s,72℃40 s,反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 根據(jù)凝膠回收試劑盒說明回收目的條帶。用BamHⅠ和XhoⅠ對該目的基因進(jìn)行雙酶切,回收純化之后克隆到同樣酶切處理的pET-32a(+）中,連接反應(yīng)在16℃過夜進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布含氨芐青的LB平板,37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落,在含氨芐青的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。陽性質(zhì)粒送南京思普金生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 重組表達(dá)菌株BL21-E2的構(gòu)建與蛋白質(zhì)表達(dá) 經(jīng)序列測定正確的重組質(zhì)粒pET32a-E2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3）感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃過夜培養(yǎng)。取過夜培養(yǎng)的菌液接種于新的培養(yǎng)基中, 37℃培養(yǎng)至OD600約0.6～0.8,加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h,離心后超聲裂解細(xì)菌,沉淀與上清液分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。蛋白質(zhì)純化方法參照GE公司HisTrap HP親和純化柱操作說明進(jìn)行。分光光度計(jì)測定蛋白質(zhì)濃度,分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組蛋白質(zhì)的Western blot鑒定 SDSPAGE結(jié)束后,采用半干轉(zhuǎn)印法將重組蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至NC膜(Pall）上,用含50 g/L脫脂乳的PBST封閉2.0 h；分別加入1∶100稀釋的BDV陽性羊血清和1∶1 000稀釋的Anti-His單克隆抗體,室溫孵育2.0 h；PBST洗滌3次；分別加入1∶2 000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP和山羊抗鼠IgGHRP,室溫輕搖1.5 h；PBST洗滌3次,DAB顯色試劑盒顯色。

1.2.5 間接ELISA檢測方法的建立

1.2.5.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的選擇 按照方陣法確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋度。以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將原核表達(dá)的E2蛋白質(zhì)分別稀釋至終濃度為4.0 μg/ml、2.0 μg/ml、1.0 μg/ml、0.5 μg/ml,4℃過夜包被酶標(biāo)板。PBST洗滌3次后,加入以1∶25、1∶50、1∶100倍稀釋的BDV陽性血清和陰性血清,每個(gè)稀釋度重復(fù)1次,取其平均值,計(jì)算每個(gè)條件下陽性血清OD值與陰性血清OD值比值(P/N）。選擇陽性血清OD值接近1.0,P/N值最大的反應(yīng)條件作為ELISA的最佳反應(yīng)條件。

1.2.5.2 封閉液的選擇 參照方法1.2.5.1中確定的最佳抗原濃度包被酶標(biāo)板,分別用含50 g/ml的脫脂乳、10 g/ml的明膠、20 g/ml的BSA、5%的馬血清的PBST 1孔200 μl 37℃封閉2 h。檢測7份陽性血清和1份陰性血清,計(jì)算P/N值以篩選最佳封閉液。

1.2.5.3 待檢血清作用時(shí)間 按上述篩選條件包被封閉酶標(biāo)板后,加入陰性、陽性血清于37℃分別作用0.5 h、1.0 h、1.5 h,計(jì)算P/N值,篩選最佳作用時(shí)間。

1.2.5.4 二抗?jié)舛葍?yōu)化 按上述條件進(jìn)行包被封閉加樣,洗滌后分別加入1∶20 000、1∶30 000、1∶40 000、1∶50 000倍稀釋的兔抗山羊IgG-HRP 100 μl進(jìn)行ELISA檢測并計(jì)算P/N值以篩選二抗?jié)舛取?/p>

1.2.5.5 二抗作用時(shí)間優(yōu)化 按上述條件進(jìn)行包被封閉加樣,加入二抗后37℃分別孵育30 min、45 min、60 min,通過測定ELISA檢測結(jié)果的OD值,比較P/N值以選擇最適二抗作用時(shí)間。

1.2.5.6 顯色時(shí)間優(yōu)化 按照前面篩選條件進(jìn)行ELISA試驗(yàn),加入TMB后分別顯色5 min、10 min、15 min。計(jì)算P/N值,篩選最佳顯色時(shí)間。

1.2.6 ELISA臨界值確定 將經(jīng)瑞典Svanova公司BDV抗體ELISA檢測試劑盒和Western blot檢測均為陰性的山羊血清樣品40份,用建立的ELISA方法檢測,計(jì)算平均值(X）和標(biāo)準(zhǔn)差(SD）,以X+2SD作為陰性判定標(biāo)準(zhǔn),X+3SD作為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.7 特異性試驗(yàn) 用建立的ELISA方法對CSFV、BVDV陽性血清進(jìn)行檢測,驗(yàn)證該檢測方法的特異性。

1.2.8 臨床血清樣品檢測 用該ELISA方法對187份臨床血清樣品進(jìn)行檢測。以上述試驗(yàn)確定的判定標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),對檢測結(jié)果進(jìn)行判定,并與Svanova公司BDV抗體檢測試劑盒進(jìn)行比較,計(jì)算二者符合率。部分血清樣品同時(shí)進(jìn)行Western blot鑒定,并分別計(jì)算與Svanova試劑盒和試驗(yàn)建立的ELISA方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

RT-PCR擴(kuò)增得到目的基因條帶(圖1）,與預(yù)期擴(kuò)增大小一致。經(jīng)測序鑒定基因大小為630 bp,與目的基因一致。克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+）,轉(zhuǎn)化DH5α,提取質(zhì)粒,將PCR鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)一步經(jīng)酶切鑒定,如圖2所示,可以得到相應(yīng)的目的條帶,證明克隆成功,該質(zhì)粒經(jīng)測序證明基因序列正確并符合載體閱讀框。

圖1 BDV E2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of BDV E2 gene

2.2 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)與鑒定

挑取陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集菌體,超聲裂解后分離包涵體和上清液,與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的BL21誘導(dǎo)產(chǎn)物一起進(jìn)行SDSPAGE電泳。在40 000～50 000之間有明顯的目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶(圖3）,主要以包涵體形式存在,空質(zhì)粒(對照）無相應(yīng)條帶。用BDV陽性羊病毒血清和Anti-His單抗對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot鑒定,可檢測到特異性條帶,證明重組蛋白質(zhì)具有良好的抗原性(圖4）。對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,可以得到高純度的重組BDV-E2蛋白質(zhì),經(jīng)測定蛋白濃度為1.81 mg/ml,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 pET32a-E2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Restrictive digestion of recombinant plasmid pET32a-E2

圖3 重組蛋白質(zhì)BDV-E2的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant BDV-E2 protein

圖4 重組BDV-E2蛋白質(zhì)的Western blot鑒定Fig.4 Western blot analysis of recombinant BDV-E2 protein

2.3 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化及判定標(biāo)準(zhǔn)的確定

經(jīng)方陣法測定篩選陽性血清OD值(P）接近1和P/N值最大的條件,最終確定最佳抗原包被濃度為4.0 μg/ml(1孔0.4 μg）,血清最佳稀釋度為1∶50(表1）。通過設(shè)置不同反應(yīng)條件檢測7份陽性血清和1份陰性血清以陰性血清OD值(N）、陽性血清OD值(P）和P/N值為判定依據(jù),最終確定20 g/L BSA為最佳封閉液,待檢血清反應(yīng)時(shí)間為1 h,洗滌后加入1∶30 000稀釋的兔抗山羊IgG-HRP作用45 min,TMB顯色10 min(表2～表6）。

依據(jù)上述確定的反應(yīng)條件檢測40份陰性血清,計(jì)算平均值X為0.263,標(biāo)準(zhǔn)差SD為0.068。則血清OD值≤X+2SD,即小于等于0.399,判為陰性；OD值≥X+3SD,即大于等于0.467判為陽性；介于兩者之間判為可疑,重復(fù)檢測1次,若仍為可疑,即判為陽性。

表1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的優(yōu)化Table 1 Optimization of the optimum concentration of coated antigen and optimum dilution of serum

表2 封閉液的優(yōu)化結(jié)果Table 2 Optimization of blocking buffer

表3 血清最佳作用時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Table 3 Optimization of reaction time for serum samples

表4 二抗?jié)舛鹊膬?yōu)化結(jié)果Table 4 Optimization for dilution of anti-goat IgG-HRP

表5 二抗作用時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Table 5 Optimization of reaction time of anti-goat IgG-HRP

表6 底物顯色時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Table 6 Optimization of reaction time of substrate

2.4 特異性

用建立的ELISA方法檢測CSFV、BVDV陽性血清,結(jié)果OD值均小于0.2,低于陰性判定標(biāo)準(zhǔn)0.399,所以檢測與BDV同為瘟病毒屬的CSFV、BVDV陽性血清為陰性,表明本方法具有很高的特異性,不與同屬其他病毒抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.5 臨床樣品檢測

利用BDV rE2-ELISA檢測方法和Svanova公司BDV抗體檢測試劑盒同時(shí)檢測187份來自不同地區(qū)羊場的血清樣品。間接ELISA方法檢測陽性率為47.59%,陰性率為52.41%；Svanova試劑盒檢測陽性率為42.78%,陰性率為57.22%；二者陽性符合率為76.25%,陰性符合率為73.83%,總符合率為74.87%。隨機(jī)挑選44份血清進(jìn)行Western blot鑒定,與rE2-ELISA檢測符合率為79.55%,與Svanova試劑盒檢測結(jié)果符合率為72.73%。

3 討論

羊邊界病病毒(BDV）所致疾病大多為不明顯的先天性疾病,少見大流行或者暴發(fā)流行,以母羊生殖障礙和羔羊多種畸形發(fā)育為主要特征[7-9]。因1959年首次發(fā)現(xiàn)于英國的英格蘭和威爾士邊界地區(qū)的羊群中而得名,是一種呈世界性分布的病毒性疾病。該病毒主要感染動(dòng)物為綿羊和山羊,偶有牛、豬和其他野生反芻動(dòng)物的感染[10]。目前,檢測BDV的方法較少,大多檢測BDV病原的方法都是依靠檢測病原基因組,包括RT-PCR方法和熒光定量方法[11]。檢測BDV抗體的試劑盒罕見,通用的試劑盒為瑞典Svanova公司生產(chǎn)的BDV抗體檢測試劑盒。由于BDV為國內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的病毒,在該病毒的毒力、檢測方法等方面均沒有系統(tǒng)研究。本研究首次通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了重組BDV-E2蛋白質(zhì),并用Anti-His單抗進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)能與Anti-His單抗發(fā)生反應(yīng),證實(shí)該蛋白質(zhì)成功表達(dá)。同時(shí),用Svanova BDV抗體試劑盒檢測為陽性的山羊血清鑒定表達(dá)的重組BDV-E2蛋白質(zhì),在目的蛋白質(zhì)處也出現(xiàn)明顯條帶,證明該蛋白質(zhì)能與BDV陽性血清發(fā)生反應(yīng),可以用作建立間接ELISA方法時(shí)的抗原,為成功建立BDV檢測方法打下基礎(chǔ)。

E2基因是瘟病毒的主要保護(hù)性抗原編碼基因, ELISA檢測方法則以其快捷、特異、敏感以及操作簡便等特點(diǎn)成為目前動(dòng)物疫病研究常用的診斷技術(shù),尤其是針對大批量的樣品檢測時(shí),其優(yōu)勢更為突出。研究利用原核表達(dá)的BDV-E2蛋白質(zhì)作為包被抗原,建立的間接ELISA方法對與BDV同屬的CSFV、BVDV陽性血清進(jìn)行檢測,結(jié)果均為陰性,表明建立的ELISA方法具有良好的特異性,排除了屬間的交叉反應(yīng)。

進(jìn)行臨床血清樣品檢測時(shí),研究建立的rE2-ELISA方法與Svanova試劑盒檢測結(jié)果陽性符合率為76.25%,陰性符合率為73.83%,總符合率為74.87%。由于試驗(yàn)建立的ELISA檢測方法采用的抗原為原核表達(dá)的E2蛋白質(zhì),檢測的是針對該蛋白質(zhì)上抗原表位的抗體；而Svanova試劑盒包被的抗原則為全病毒,檢測的抗體可能針對E2表位,也可能包含其他表位；同時(shí)由于BDV不同地區(qū)分離毒株之間蛋白質(zhì)差異較大,均可能導(dǎo)致二者檢測結(jié)果的差異。在用Western blot進(jìn)行鑒定的結(jié)果比較中,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)建立的ELISA檢測方法與其符合率為79.55%,Svanova試劑盒檢測結(jié)果與其符合率為72.73%,分析導(dǎo)致這種差異的可能原因?yàn)榈鞍踪|(zhì)變性前后,E2蛋白質(zhì)表位的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化以及不同毒株間E2蛋白質(zhì)的差異性,導(dǎo)致了3種檢測方法之間各有所不同。臨床樣品檢測結(jié)果表明本研究建立的間接ELISA方法檢測結(jié)果較為理想,特異性較高,為羊群邊界病的監(jiān)測以及臨床血清樣品的快速有效檢測、開發(fā)BDV抗體檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：袁 偉）

Prokaryotic expression of border disease virus E2 and establishment of an indirect ELISA for serum antibody detection

MAO Li1, LIU Xia1,2, LI Wen-liang1, YANG Lei-lei1, ZHANG Wen-wen1, WEI Jian-zhong2, JIANG Jie-yuan1

(1.Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology,Ministry of Agriculture/National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products,Nanjing210014,China；2.College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China）

Border disease virus(BDV）is main pathogen causing reproductive manifestations of sheep and goat.To develop an ELISA for detection of the specific antibody of BDV,the antigenic region of BDV E2 protein was amplified by RT-PCR,and cloned into pET-32a(+）.The positive plasmid was transformed to BL21 and the recombinant bacteria were obtained.The recombinant protein was identified by SDSPAGE andWesternblot.TheindirectELISAwas developed successfully through the optimization of reaction system which involved coated antigen of 4.0 μg/ml,sealing buffer of 20 g/L BSA,serum sample at 1∶50 dilutionand incubation for 1 h at 37℃,HRP conjugated rabbit anti-pig IgG at 1∶30 000 dilution and the reaction time of 45 min at 37℃,and colour development at room temperature for 10 min.Coating antigen had no cross reaction with the antibodies against BVDV and CSFV.The rE2-ELISA showed a BDV positive coincidence rate of 76.25%and a total coincidence rate of 74.87%with Svanova ELISA kit.Western blot identification revealed a coincidicen rate of 79.55%in 44 serum sample,higher than that identified by Svanova ELISA kit.It was indicated that the rE2-ELISA was suitable for large-scale epidemiological investigation for BDV infection.

border disease virus；E2 protein；indirect ELISA

Q939.4

A

1000-4440(2015）01-0093-07

毛 立,劉 霞,李文良,等.邊界病病毒E2蛋白質(zhì)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31 (1）：93-99.

10.3969/j.issn.1000-4440.2015.01.014

2014-06-18

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX(14）2090]

毛 立(1985-）,男,湖北荊州人,助理研究員,主要從事動(dòng)物疫病診斷技術(shù)研究。(E-mail）mao-li@live.cn

江杰元,(E-mail）jieyuanj57@gmail.com