王進(jìn)闖， 王敬國(guó)

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南?？?571101)

大豆連作土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)的影響

王進(jìn)闖1, 2， 王敬國(guó)1*

(1中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南海口 571101)

連作； 大豆； 線蟲群落； T-RFLP； 定量PCR

土壤健康是農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)的重要保證，而土壤生物的群落結(jié)構(gòu)決定了土壤的健康狀況，土壤生物群落結(jié)構(gòu)的變化可作為土壤變化的早期預(yù)警生態(tài)指標(biāo)[1]。線蟲群落包括不同營(yíng)養(yǎng)類群：植物寄生線蟲、食細(xì)菌線蟲、食真菌線蟲、捕食性和雜食性線蟲，是土壤動(dòng)物中數(shù)量最多、功能最豐富的一類[2]。線蟲影響著土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)以及病害的發(fā)生，被認(rèn)為是土壤健康狀況的敏感性指示生物[3]。

通常研究土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)的方法是形態(tài)分類，這需要具有分類經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)技術(shù)人員，而且在鑒定上費(fèi)時(shí)費(fèi)工，很難在短期內(nèi)獲得結(jié)果[15]。同時(shí)，鑒定的結(jié)果往往是在屬、科和營(yíng)養(yǎng)類群的水平，使生態(tài)分析往往比較模糊或表面化[16]。形態(tài)分類的另一個(gè)缺點(diǎn)是只能鑒定成蟲標(biāo)本，而成蟲僅是全部線蟲群落的很小的一部分[17]，不能全面反映土壤的線蟲狀況。利用分子生物學(xué)方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不必分離和培養(yǎng)線蟲，僅通過設(shè)計(jì)引物就可以鑒定一個(gè)土壤系統(tǒng)中的線蟲群落。末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)已被證實(shí)是研究不同生境中線蟲群落的有效方法[18-21]。

本文利用T-RFLP和qPCR技術(shù)，研究了長(zhǎng)期大豆連作根際土壤中線蟲群落的結(jié)構(gòu)和豐度的變化，特別是比較短期連作和長(zhǎng)期連作線蟲群落的差異。另外，通過相關(guān)性分析，確定引起土壤線蟲群落變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，有助于理解長(zhǎng)期連作大豆土壤線蟲群落的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

1.2 大豆品種

供試大豆材料為合豐25號(hào)。選用的品種適應(yīng)性強(qiáng)，且莖稈堅(jiān)韌、節(jié)間短小、結(jié)莢密實(shí)，因而它有適應(yīng)性強(qiáng)、高產(chǎn)和早熟等優(yōu)良特性。目前，合豐25號(hào)是黑龍江省主要的種植品種。2009年4月，開始種植大豆，播種密度為每平方米30顆種子，每個(gè)樣地包括10行(長(zhǎng)×寬為15 m×0.67 m)，按當(dāng)?shù)赝扑]的施肥量施用底肥(N 50 kg/hm2、P 45 kg/hm2和K 50 kg/hm2)。

1.3 土壤樣品采集與制備

在試驗(yàn)田采用“Z”形設(shè)點(diǎn)，于2009年9月12日大豆成熟期取樣，選取種植大豆1、2、3、6、9、11和13年的試驗(yàn)小區(qū)，收獲30株大豆，連根拔起植株。用抖根法采集根際土，即抖動(dòng)植株至土壤不再下落，粘在根系的即為根際土壤。土壤樣品含水量為(16±3)%。根際土壤過2 mm篩，去除植物組織和土壤雜質(zhì)。采集的樣品放于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-20℃保存。

1.4 土壤總DNA的提取和PCR擴(kuò)增

1.4.1 土壤總DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)的土壤DNA提取采用FastDNA SPIN Kit for Soil試劑盒(Bio 101, Carlsbad，CA，USA)。提取出來(lái)的土壤基因組DNA在-20℃冰箱中保存、備用。DNA通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA green染色，成像系統(tǒng)拍照。

1.4.2 PCR擴(kuò)增和純化 線蟲擴(kuò)增引物對(duì)為NEMF1(5′-CGC AAA TTACCC ACT CTC-3′)和S3(5′-AGT CAA ATT AAG CCG CAG-3′)[18]。進(jìn)行T-RFLP分析時(shí)，引物NEMF1 5'端用6-羧基熒光素(FAM)標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系(50 μL)含DNA模板1 μL，EasyTaq 緩沖液5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)4 μL，NEMF1(10 mmol/L)0.6 μL，S3(10 mmol/L) 0.6 μL，Easy taq聚合酶(5 units/μL)(全氏金)0.6 μL，雙蒸水(ddH2O)38.2 μL。

總而言之，根據(jù)本次研究數(shù)據(jù)就進(jìn)一步證明了對(duì)急性腦卒中患者康復(fù)過程中實(shí)施良肢位擺放護(hù)理具有顯著地效果。良肢位擺放護(hù)理可以根據(jù)患者的實(shí)際情況來(lái)制定具有針對(duì)性的護(hù)理方案，從而提高患者在護(hù)理過程中的舒適度與滿意度。因此，良肢位擺放護(hù)理應(yīng)該被積極應(yīng)用在臨床實(shí)踐的過程中。

PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)：94℃變性1 min，53℃引物退火45 s，72℃延伸1 min。最后72℃末端延伸10 min。PCR產(chǎn)物3 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠回收型試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)對(duì)PCR產(chǎn)物純化，-20℃保存。

1.5 T-RFLP分析

在3 μL PCR產(chǎn)物中，加入0.6 μLTaqⅠ限制性內(nèi)切酶(Takara)，2 μL緩沖液，最后用ddH2O補(bǔ)足到反應(yīng)總體積10 μL。65℃，遮光酶切3 h。酶切產(chǎn)物用乙醇沉淀法純化，純化產(chǎn)物用錫箔紙包裹，在-20℃下保存。在1 μL酶切純化產(chǎn)物中加入8.8 μL甲酰胺，0.2 μL Rox 1000內(nèi)標(biāo)(Bioventures Int., 美國(guó))，共10 μL混合液，然后加到96孔板，要避免產(chǎn)生氣泡，否則可能損壞遺傳分析儀。在95℃變性3 min，然后迅速移到冰上冷卻3 min。在ABI 3130自動(dòng)測(cè)序儀上檢測(cè)時(shí)，電壓為2500 V，電流40 Ma，功率27 W。末端帶熒光標(biāo)記的片段能被自動(dòng)檢測(cè)到，而其它沒有帶熒光標(biāo)記的片斷檢測(cè)不到。用Peak Scanner Software v1.0分析T-RFLP圖譜，然后將末端限制性片段(T-RF) > 50 bp的峰高計(jì)算不同片段的相對(duì)豐度。

表1 大豆連作根際土壤性質(zhì)、類黃酮、大豆苷元和染料木素含量Table 1 Soil properties and concentrations of isoflavones, daidzein and genistein in the rhizosphere soil over years of mono-cropping

注(Note): 同列數(shù)據(jù)是平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤Date are means±SD (n=3). 不同的字母表示在P<0.05水平上年份間存在顯著差異 Different letters mean significant difference among different years atP<0.05 level. 數(shù)據(jù)來(lái)源于Guo等[22]和Wang等[23]Data are adapted from Guoetal.[22]and Wangetal.[23].

1.6 克隆及測(cè)序分析

用與T-RFLP序列相同但不帶熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件也與T-RFLP的相同。以PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化。純化產(chǎn)物采用pMD 19-T Vector (Takara)試劑盒連接到載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Takara)，涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)、X-Gal和IPTG的LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，約12h，形成單菌落。隨機(jī)選取170個(gè)白色克隆子，采用菌體直接擴(kuò)增，檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆送往測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為M13-47。先用Clustal X軟件對(duì)所得序列去除載體序列[25]，然后利用RDPⅡ在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera.cgi?su=SSU)去除PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的嵌合體。然后用Clustal X和Mega5.0軟件分析比對(duì)，采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用絕對(duì)定量的方法確定線蟲群落的大小。用陽(yáng)性克隆質(zhì)粒繪制線蟲基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。引物為NEMF1/NEM896r(5′-TCC AAG AAT TTC ACC TCT MAC G-3′)。實(shí)驗(yàn)采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(ABI)，在7500 Real Time PCR system(ABI)儀器上進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 25 μL反應(yīng)體系為：12.5 μL SYBR Green；引物各1 μL(10 μmol/L)，5 μL ddH2O，0.5 μL BSA(0.1%)，模板DNA 5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 2 min，啟動(dòng)dUTP防止非特異性擴(kuò)增；95℃ 10 min，激活熱啟動(dòng)酶；然后45個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)：94℃變性1 min，53℃引物退火45 s，72℃延伸1 min，72℃收集熒光信號(hào)，最后做溶解曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用7500 system SDS Software(ABI)分析定量結(jié)果。

1.8 數(shù)據(jù)處理

利用Mental test確定環(huán)境因子對(duì)線蟲群落的影響。布雷柯蒂斯(Bray-Curtis)距離用來(lái)進(jìn)行非度量多維尺度分析(NMDS)，分析群落的變化。Mental test和NMDS均在R軟件vegan軟件包中進(jìn)行。方差分析和相關(guān)性分析在SPSS 17軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 線蟲群落結(jié)構(gòu)

線蟲的物種豐富度隨著連作年限的增加呈逐漸降低的趨勢(shì)。第1年物種豐富度最高，為12，第3年的豐富度顯著低于第1年(P<0.05)，之后逐漸降低，連作9年后達(dá)到最小值，為5(圖1)。

圖1 長(zhǎng)期連作大豆根際土壤線蟲群落 的物種豐富度變化Fig.1 Changes of species richness of nematode communities in long-term continuous soybean monoculture[注(Note)： 數(shù)據(jù)是平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤Date are means ± SD (n=3). 方柱上不同字母表示在P<0.05水平存在顯著差異 Different letters above bars are significantly different at P<0.05 level (according to Duncan’s new multiple range tests).]

圖2 長(zhǎng)期大豆連作線蟲群落的結(jié)構(gòu)和組成 (基于線蟲基因的T-RFLP分析)Fig.2 Compositions and structures of nematode communities in the long-term continuous soybean monoculture as determined by the T-RFLP analysis

2.2 線蟲群落組成與環(huán)境的關(guān)系

T-RFLP分析中的大多T-RF能從克隆文庫(kù)中鑒定(圖3)。在大豆根際土中，線蟲群落由莖線蟲屬(Ditylenchus對(duì)應(yīng)416 bp和556 bp)、真滑刃屬(Aphelenchus對(duì)應(yīng)553 bp)、擬麗突屬(Acrobeloides對(duì)應(yīng)62 bp、74 bp、556 bp和557 bp)、針屬(Paratylenchus對(duì)應(yīng)418 bp、549 bp、555 bp和558 bp)、盤旋屬(Rotylenchus對(duì)應(yīng)562 bp)、孢囊屬(Heterodera對(duì)應(yīng)559 bp和560 bp)、中小桿屬(Mesorhabditis對(duì)應(yīng)73 bp、75 bp和522 bp)組成。線蟲群落主要分成植食性線蟲、食細(xì)菌線蟲和食真菌線蟲，沒有檢測(cè)到雜食性線蟲(圖3)。

圖3 線蟲克隆文庫(kù)系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic relationship of representative nematode clone sequences

NMDS分析顯示，第1年線蟲群落與其余年限分開，而第2和第3年聚集較近，后面第9、11和13年聚集較近(圖4)。說(shuō)明短期連作導(dǎo)致了群落的明顯變化，隨著連作年限的增加，線蟲群落進(jìn)一步分化，暗示了連作時(shí)間對(duì)線蟲群落結(jié)構(gòu)并沒有恢復(fù)。Mantel test分析顯示環(huán)境與線蟲群落之間存在顯著的關(guān)系(相關(guān)系數(shù)r=0.368，P<0.001)，暗示了環(huán)境條件對(duì)于群落的變化起到了部分的作用。線蟲群落結(jié)構(gòu)與pH、土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)、速效磷(AP)、細(xì)菌數(shù)量和真菌數(shù)量相關(guān)(圖4)。

2.3 定量分析

圖4 NMDS分析長(zhǎng)期大豆連作的線蟲群落結(jié)構(gòu) 與環(huán)境的關(guān)系Fig.4 Nonmetric multi-dimensional scaling (NMDS) plots showing similarity between nematode community structures from the continuous soybean monoculture system[注(Note)： BA—細(xì)菌豐度；FA—真菌豐度；AP—速效磷；SOM—土壤有機(jī)質(zhì).]

圖5 長(zhǎng)期大豆連作線蟲的基因拷貝數(shù)變化Fig.5 Gene copies of soil nematode in the long-term continuous soybean monoculture[注(Note)： 數(shù)據(jù)是平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤Date are means±SD (n=3). 不同字母表示在P<0.05水平年份間存在顯著差異 Different letters mean significant difference among different years at P<0.05 level (according to Duncan’s new multiple range tests).]

3 討論

在長(zhǎng)期連作情況下，會(huì)出現(xiàn)由致病土壤向抑病土壤的轉(zhuǎn)化。例如，許多地方的研究表明持續(xù)連作使土壤出現(xiàn)自然抑制病原線蟲的現(xiàn)象[5]。歐洲的蕎麥連作減少了胞囊線蟲(Heteroderaavenae)種群的密度[26]。在我國(guó)東北地區(qū)，大豆連作前5年，胞囊線蟲數(shù)量每250 g土增加到351個(gè)，之后開始下降，并在連作14年后降到260個(gè)[6]。

圖6 長(zhǎng)期大豆連作土壤中線蟲群落基因拷貝數(shù)和環(huán)境因子的關(guān)系Fig.6 Nematode community gene copies association with environmental factors in the long-term soybean monoculture

土壤線蟲群落的變化并不是偶然的，其消長(zhǎng)通常受土壤理化性質(zhì)和微生物的影響[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，線蟲群落結(jié)構(gòu)受有機(jī)質(zhì)、有效磷和pH值的影響，而且細(xì)菌和真菌的數(shù)量也影響著線蟲結(jié)構(gòu)(圖4)。土壤有機(jī)質(zhì)是影響土壤線蟲分布的重要因素[34]。土壤有機(jī)質(zhì)為土壤微生物提供了能源，因此增加了微生物的活性和生物量。一些食細(xì)菌線蟲的增加可能是由于微生物生物量增加引起[35]。另外，土壤pH降低通常減少了細(xì)菌生物量而有利于真菌生物量，這樣的變化能夠反映在捕食微生物的線蟲群落變化上[36-37]。番茄連作過程中，pH值與墊刃科(Tylenchidae)線蟲數(shù)量呈正相關(guān)，還有一些滑刃線蟲(Aphelenchoidesspp)對(duì)pH值具有較強(qiáng)的忍耐性[32]，說(shuō)明不同的線蟲種類對(duì)pH值的響應(yīng)存在差異，可能引起群落變化。土壤磷含量高能增加線蟲的豐度，特別是食細(xì)菌線蟲數(shù)量，改變了食真菌和食細(xì)菌線蟲數(shù)量[37]。王邵軍等[38]發(fā)現(xiàn)，柳杉根際的速效磷與墊刃線蟲(Tylenchusplatycephalus)及居尾滑刃線蟲(Aphelenchoidescomposticola)數(shù)量正相關(guān)，而與厄薩拉斯螺旋線蟲(Helicotvlenchusxallus)和雙宮螺旋線蟲(Helicotylenchusdihystera)無(wú)關(guān)。這些結(jié)果說(shuō)明連作引起的土壤性質(zhì)的改變引起了土壤線蟲群落的分化。另外，細(xì)菌和真菌是捕食微生物的食物來(lái)源，微生物的數(shù)量對(duì)線蟲群落結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)也十分明顯[33]。

本研究中并沒有檢測(cè)到捕食/雜食線蟲(Omnivores-predators)。這可能是由于研究方法的差異。本研究主要研究根際土，而且DNA是從0.5 g土壤中提取，不能全面地估計(jì)線蟲分布。因此，為了更全面研究線蟲群落結(jié)構(gòu)，需要經(jīng)典分類和分子技術(shù)相結(jié)合[42]或從更多質(zhì)量的土壤中提取DNA，再用高通量的測(cè)序方法進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)鑒定[43]。

4 結(jié)論

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Effects of continuous soybean monoculture on soil nematode community

WANG Jin-chuang1,2, WANG Jing-guo1*

(1CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,ChinaAgriculturalUniversity/MOAKeyLaboratoryofPlantNutrition,Beijing100193,China; 2EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalScience,Haikou,Hainan571101,China)

continuous monoculture; soybean; nematode community; T-RFLP; qPCR

2014-03-17 接受日期： 2014-05-27 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2015-05-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(40871121)資助。

王進(jìn)闖(1976—)，男，河北邯鄲人，博士，主要從事微生物生態(tài)學(xué)研究。E-mail：jinchuangwang@yahoo.com * 通信作者 Tel： 010-62732198， E-mail： wangjg@cau.edu.cn

S344.4； S432. 4+5

A

1008-505X(2015)04-1022-10