劉建釵，柳煥章，劉彥威，王慧真，張永英

肉雞白念珠菌病常用實(shí)驗(yàn)診斷方法比較研究

劉建釵，柳煥章，劉彥威，王慧真，張永英

目的 探究肉雞白色念珠菌病簡便快速診斷方法。方法 對50例來自不同雞場的臨床疑似樣本分別采用KOH鏡檢法、改良KOH鏡檢法、分離純化與形態(tài)觀察法、TTC顯色培養(yǎng)法、組織切片法和巢式PCR法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果 上述方法的樣本檢測陽性率分別為62.0%(31/50)、78.0%(39/50)、82.0%(41/50)、82.0%(41/50)、86%(43/50)和88.0%(44/50)，耗時分別為1～2 h、1～2 h、7～8 d、6～7 d、8～10 d和7～8 h。結(jié)論 通過比較各種常用方法的優(yōu)缺點(diǎn)，建議采用巢式PCR法與改良KOH鏡檢法相結(jié)合作為肉雞白念珠菌病簡便快速診斷的優(yōu)選方案，其特異性強(qiáng)，敏感度高，耗時少，并兼顧病原侵染狀態(tài)的直觀性。

肉雞；白念珠菌；診斷方法；巢式PCR

白念珠菌(Candidaalbicans)是經(jīng)常導(dǎo)致人和動物感染的重要條件致病真菌[1-2]。白念珠菌病在肉雞中也普遍發(fā)生，致使病雞生長緩慢，生產(chǎn)能力下降，或引起死亡，給養(yǎng)雞業(yè)帶來較大經(jīng)濟(jì)損失[3-4]，同時也給從業(yè)人員和消費(fèi)者帶來安全隱患。據(jù)報道，白念珠菌不僅是270余種念珠菌中毒力最強(qiáng)的一種[5-6]，而且還可引起免疫抑制，一旦機(jī)體被感染，容易引起繼發(fā)與混合感染[7]，所以對白念珠菌病應(yīng)盡早診斷和及時治療。由于白念珠菌感染的臨床表現(xiàn)特異性不強(qiáng)，又具有病原表型多樣性和條件致病性特點(diǎn)，致使早期感染的臨床診斷相當(dāng)困難，往往延誤或錯誤治療。因此，建立一種簡便、快速、可靠的肉雞白念珠菌病診斷方法，無論對養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，還是在公共衛(wèi)生方面都具有重要意義[8]。本研究的目的就是尋找肉雞白念珠菌病適宜的診斷方法，為該病的及時防治和進(jìn)一步的研究提供技術(shù)支持，也為其它動物白念珠菌病的診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

1.1.1 采樣雞場的肉雞品種 羅斯308(Ross 308)。

1.1.2 疑似病例參照指標(biāo) 肉雞白念珠菌病是一種消化道真菌性傳染病。臨床主要表現(xiàn)為食量減少，飲水增加，發(fā)育不良，形體瘦小；嗉囊脹大，觸感松軟，內(nèi)容物或口水氣味酸臭；嚴(yán)重病例呼吸急促，下痢，糞便呈灰白色，脫水衰竭而死亡。主要病理特征是在口腔、咽喉、食道、嗦囊和腺胃等消化道黏膜上形成乳白色斑片并導(dǎo)致黏膜發(fā)炎、潰瘍或鱗屑狀病變。其中典型的剖檢病變是嗉囊內(nèi)表面有豆腐渣樣物呈假膜覆蓋[9]，是本病與傳染性腺胃炎、雞腎型傳染性支氣管炎等具消化道癥狀疾病的主要區(qū)別。

1.1.3 病料采集與處理 從河北省石家莊地區(qū)某肉雞養(yǎng)殖小區(qū)的5個雞場各選取白念珠菌病疑似病雞10只，每只采取嗉囊內(nèi)表面附著內(nèi)容物1 g左右，放入1.5 mL滅菌EP管中備用(共50份)；同時用滅菌剪刀剪取內(nèi)容物取樣處的嗉囊小塊組織(1 cm×1 cm)各1份(共50份)，放入4%甲醛固定液中固定24 h待用。

1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒為Solarbio公司產(chǎn)品；PCR試劑盒、DNA Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；真菌鑒定通用引物與白念珠菌特異引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司合成。

PDA慶大霉素培養(yǎng)基(Ⅰ)、玉米粉吐溫瓊脂培養(yǎng)基(Ⅱ)、TTC(氯化三苯四氮唑)-沙氏瓊脂培養(yǎng)基(Ⅲ)為自制。

試驗(yàn)對照菌株：白念珠菌(Candidaalbicans)、熱帶念珠菌(Candidatropicalis)和光滑念珠菌(Candidaglabrata)菌種為本單位分離保藏。

1.3 樣本鏡檢 ① KOH法：參考劉彥威等方法[10]，以看到特征性菌絲和孢子者為陽性結(jié)果，連續(xù)兩次檢查均未看到特征性菌絲或孢子者為陰性結(jié)果。樣本檢測的敏感程度可用陽性率表示，計(jì)算方法：樣本檢測陽性率=(陽性樣本數(shù) / 檢測樣本總數(shù))×100%。② 改良KOH法：取少許內(nèi)容物樣本置載玻片上，加改良復(fù)方KOH溶液(KOH 15 g加入30 mL蒸餾水中溶解后，依次加入DMSO 40 mL，甘油20 mL，加入蒸餾水至1 000 mL混勻)1～2滴，自然干燥或加熱干燥后，火焰固定，滴一滴結(jié)晶紫染色30 s左右，水洗，加蓋玻片鏡檢。陽性與陰性結(jié)果判斷參照KOH法。

1.4 病原分離純化與形態(tài)觀察 將每個內(nèi)容物樣本取0.3 g分別置于1.5 mL滅菌EP管中，加入0.7 mL滅菌蒸餾水，封蓋，瞬時振蕩，用無菌棉簽沾取懸液于Ⅰ號培養(yǎng)基平板涂劃接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h；用接種環(huán)挑取疑似菌落于Ⅰ號培養(yǎng)基平板劃線分離，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h；將疑似單菌落取菌體革蘭氏染色鏡檢，將革蘭氏陽性反應(yīng)且為酵母狀細(xì)胞的相應(yīng)菌落取菌體分別接種于Ⅱ號培養(yǎng)基的平板和無菌載片，于37 ℃恒溫、保濕培養(yǎng)3～4 d，觀察平板菌落特征并直接鏡檢載片培養(yǎng)物形態(tài)特征。將同時看到菌絲狀菌落、菌絲(芽管)、厚垣孢子形態(tài)者記錄為陽性結(jié)果。

1.5 TTC顯色培養(yǎng) 參考?xì)W陽珂珮等方法[1]，用接種環(huán)挑取從各樣本分離純化的疑似單菌落的菌體接種于Ⅲ號培養(yǎng)基平板的劃定區(qū)域，在同一平板的相鄰區(qū)域分別接種熱帶念珠菌和光滑念珠菌作對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察顯色結(jié)果。以出現(xiàn)乳白色至淡粉色菌落(菌苔)者為陽性結(jié)果，其他顏色為陰性結(jié)果。

1.6 組織切片制作與觀察 將疑似白念珠菌感染的病雞嗉囊組織樣本從甲醛固定液中取出，經(jīng)修塊、脫水、透明、浸蠟包埋、切片和 Cott-Gomori 六胺銀染色，觀察組織病理和病原形態(tài)，顯微照相。以組織中出現(xiàn)特征性菌絲和孢子形態(tài)者為陽性結(jié)果。

1.7 DNA的提取與巢式PCR 將每個內(nèi)容物樣本取0.2 g放在研缽中，加適量液氮研磨至漿狀備用；陽性對照用白念珠菌培養(yǎng)物，陰性對照用未患病雞嗉囊內(nèi)容物，特異性對照用光滑念珠菌和熱帶念珠菌培養(yǎng)物。試樣與對照的DNA提取方法按Solarbio試劑盒說明進(jìn)行。

第1輪PCR采用真菌rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū)(ITS)序列通用引物(ITS1 5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)和(ITS4 5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)對樣本和對照DNA提取物進(jìn)行擴(kuò)增，目的片段大小為660 bp。PCR反應(yīng)體系為：Mix 25 μL，引物1.0 μL，模板 DNA 4.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；于4 ℃終止反應(yīng)。

第2輪(巢式)PCR采用白念珠菌特異性引物[11](CALB1 5′- TTT ATC AAC TTG TCA CAC CAG A -3′)和(CALB2 5′-ATC CCG CCT TAC CAC TAC CG -3′)，目的片段大小為273 bp。反應(yīng)體系為50 μL：將第1輪PCR產(chǎn)物1∶6稀釋作為DNA 模板，引物用CALB1和CALB2，其他與第1輪相同。反應(yīng)條件：退火溫度為58 ℃，其余條件與第1輪PCR相同，共40循環(huán)。取5 μL巢式PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行常規(guī)電泳，照相并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 樣本鏡檢 ①KOH法：在顯微鏡下觀察，視野中背景較雜亂，陽性病料中可見菌絲和孢子形態(tài)，但不夠清晰(圖1A)；②改良KOH法：視野背景較為清晰，可清楚觀察到分隔菌絲及厚壁孢子(圖1B)。樣本檢測陽性結(jié)果、陰性結(jié)果、陽性率與時間消耗見表1。

2.2 分離純化與形態(tài)觀察 將各樣本在Ⅰ號培養(yǎng)基分離純化得到的疑似純菌落，進(jìn)一步用Ⅱ號培養(yǎng)基平板和載片培養(yǎng)，4 d后觀察發(fā)現(xiàn)在41份樣本分離出的單菌落中都出現(xiàn)了陽性結(jié)果。陽性分離株在Ⅰ號培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后的菌落形態(tài)如圖2A；在Ⅱ號培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后的菌苔如圖2B箭頭所示；陽性分離菌株絲狀菌落涂片革蘭氏染色后的形態(tài)如圖3A；載片培養(yǎng)物直接鏡檢形態(tài)如圖3B-C。

A：KOH法處理嗉囊內(nèi)容物的顯微鏡觀察，示絲狀菌體與孢子(400×)；B：改良KOH法，示菌絲和厚壁孢子(400×)

A: Microscopic examination of sample from crop by KOH method, showing mycelia and spores(400×); B: By modified KOH method, showing mycelia and chlamydospores(400×)

圖1 KOH法和改良 KOH法處理嗉囊內(nèi)容物的顯微鏡觀察(400×)

Fig.1 Microscopic examination of sample from crop by KOH method and by modified KOH method(400×)

A：陽性分離菌株普通菌落；B：菌絲狀菌落；C：TTC顯色培養(yǎng)，白色菌苔為陽性

A：陽性分離菌株酵母狀細(xì)胞與菌絲(400×)；B：菌絲與厚壁孢子(400×)；C：芽孢子及其芽管(400×)

A: Yeast-like cells and mycelia of positive isolates (400×); B: Mycelia and chlamydospores (400×); C: Blastospores and germ tubes (400×)

圖3 陽性分離菌株顯微形態(tài)

Fig.3 Micromorphology of the positive isolates

2.3 TTC顯色培養(yǎng) 在Ⅲ號培養(yǎng)基平板上白念珠菌菌苔呈乳白色(如圖2C箭頭所示)，熱帶念珠菌為深紅色或紫色，光滑念珠菌或其他酵母菌為紅色或生長勢很弱。

2.4 組織切片 將疑似病雞嗉囊組織切片鏡檢，陽性樣本可見嗉囊的黏膜復(fù)層扁平上皮明顯增厚，并發(fā)生角質(zhì)化和上皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象，大量菌絲穿過粘膜上皮深達(dá)黏膜下的腺體中(圖4A-B)。

A：病雞嗉囊病理組織切片鏡檢，示大量白念珠菌菌絲(100×)；B：示病變組織中的大量菌絲(400×)

A:Histopathologic slide of chicken crop, showing great deal ofCandidaalbicansmycelia (100×); B: Showing great deal of mycelia in lesion tissue (400×)

圖4 病雞嗉囊病理組織切片鏡檢

Fig.4 Microscopy of histopathologic slide with the sick chicken crop

2.5 巢式PCR 以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，通過第2輪(巢式)PCR，從每個樣本擴(kuò)增產(chǎn)物中取5 μL進(jìn)行電泳，陽性對照與陽性樣本均出現(xiàn)273 bp的目的條帶；陰性對照與特異性對照均未見明顯條帶出現(xiàn)(圖5)。

M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control; 2: Positive control; 3-7: Specimens; 8:Candidaglabrata; 9:Candidatropicalis.

圖5 樣品巢式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

Fig.5 Electrophoresis results of nested PCR of specimens

表1 肉雞白念珠菌病不同檢測方法的比較

3 討 論

將含有真菌病原體的病料直接涂片鏡檢來檢測真菌病的方法簡便、快速，可為臨床診斷真菌感染提供早期依據(jù)。該法常用KOH試劑為載浮液，有關(guān)KOH法檢測病料中真菌病原體的報道主要集中于皮膚真菌感染的病例[10,12]，對動物消化道內(nèi)容物真菌病原物檢查鮮見報道。本試驗(yàn)用KOH法檢查疑似白念珠菌病病雞的消化道內(nèi)容物，結(jié)果其陽性率為62.0%；為提高鏡檢的陽性率，我們同時采用改良KOH法做平行試驗(yàn)，使鏡檢陽性率提高到78.0%。其原因可能是在改良KOH法中，增加了載浮液甘油和KOH濃度，并新添了二甲基亞砜，增強(qiáng)樣本的溶解和背景的透明度，使視野更清楚，菌絲和孢子較易觀察到，從而使陽性率明顯提高。此類方法由于受到特異性和敏感性的限制，只能初步判斷真菌感染，而不能確定病原真菌的種類和性質(zhì)。

由于白念珠菌雙相性和表型多樣的特點(diǎn)，其形態(tài)和培養(yǎng)特征往往被用于病原檢測的重要依據(jù)。孢子相和菌絲相的相互轉(zhuǎn)變是白念珠菌的重要特性，而且菌絲形式更易附著、破壞和侵入宿主組織，因而具有更強(qiáng)的致病力[5,13]。醫(yī)學(xué)上檢測必須同時觀察到孢子和菌絲(芽管)才有診斷意義[14]。本試驗(yàn)將從各樣本分離的疑似菌株通過在不同條件下培養(yǎng)，觀察其菌落、菌苔、酵母狀細(xì)胞、絲狀菌體、厚壁孢子、芽孢子與芽管等形態(tài)特征，得到檢測樣本的陽性率為82%。該法比樣本鏡檢法的特異性好，敏感度高，但過程繁瑣、耗時長，陽性率結(jié)果會受到取樣、分離、純化過程和培養(yǎng)條件等影響，仍存在一定假陰性結(jié)果。

顯色培養(yǎng)法是在培養(yǎng)基中加入特定顯色物質(zhì)，利用不同培養(yǎng)物的生理與代謝差異使菌落或基質(zhì)產(chǎn)生特征性顏色從而鑒別菌種的方法。本試驗(yàn)采用TTC顯色培養(yǎng)基對分離純化的疑似菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果陽性率為82%，與形態(tài)觀察法相同，說明兩者的敏感度相似。由于此法仍需要前期的菌株分離純化和后期的顯色培養(yǎng)過程，同樣存在耗時長和假陰性的問題。與形態(tài)觀察法相比，此法相對簡便，且具有較好的特異性，在臨床診斷中有一定應(yīng)用價值。

組織切片法可以直接觀察到組織的病理變化和侵入組織的病原特征，因此被學(xué)界視為病原真菌侵染狀態(tài)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。組織切片法具有侵染的直觀性和特異性較好的優(yōu)點(diǎn)，但對設(shè)備和技術(shù)條件要求相對較高、操作步驟多、耗時長，而且樣本檢測陽性率會受到取樣時間、部位及操作過程的影響，也存在假陰性的問題。本研究中的樣本檢測陽性率為86%，次于巢式PCR法(88%)，但耗時最長(8～10 d)。

目前國內(nèi)外學(xué)者已將多種分子生物學(xué)方法引入念珠菌病原鑒定和臨床診斷[15-16]。其中，采用rDNA區(qū)以及rRNA小亞基相應(yīng)序列分析，特別是轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析被認(rèn)為是進(jìn)行真菌種間分類及種內(nèi)分型的最可靠方法之一[17]。這些分子生物學(xué)的方法是基于樣本中有較豐富的DNA含量。臨床樣本中病原真菌DNA豐度一般較低，難以用PCR方法一次性準(zhǔn)確檢測病原物的存在。鑒于此，本試驗(yàn)采用巢式PCR方法，用真菌通用引物對病料樣品中痕量DNA進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，以其擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，用白念珠菌特異引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增(ITS序列中的特異片段)，從而提高了樣本檢測的敏感性和特異性。巢式PCR法在本試驗(yàn)的各種檢測方法中陽性率最高(88%)，且耗時較短，這與Emma等的結(jié)論基本一致[18]。

綜上所述，在肉雞白念珠菌病的診斷中，建議采用巢式PCR法與改良鏡檢法結(jié)合，既保證診斷的特異性和敏感性，又可兼顧病原侵染狀態(tài)的直觀性和診斷效率。在不具備上述診斷條件或?qū)υ\斷時間要求不緊迫的情況下，可采用病原特異性顯色培養(yǎng)或特征性形態(tài)觀察與臨床、剖檢癥狀相結(jié)合的方法；組織病理檢驗(yàn)可作為上述方法的補(bǔ)充或確定白色念珠菌感染狀態(tài)的依據(jù)。

本次試驗(yàn)僅研究比較了肉雞白念珠菌病的6種診斷方法，樣本數(shù)量較少，在樣本處理和檢測中對其它病原和非病原微生物的干擾問題考慮不足，因而研究結(jié)果尤其陽性率結(jié)果可能受到一定影響，這些問題有待于后續(xù)研究改進(jìn)。

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Comparison research on commonly experimental diagnostic methods of candidiasis albicans in broiler chicken

LIU Jian-chai,LIU Huan-zhang,LIU Yan-wei,WANG Hui-zhen,ZHANG Yong-ying

(EngineeringResearchCenterofHebeiProvinceofPoultryDisease,CollegeofAgriculture,HebeiUniversityofEngineering,Handan056021,China)

In order to study handy and quick diagnosis of candidiasis albicans of broiler chicken, assays using 50 clinical suspected samples from several chicken farms were performed by methods of KOH microscopic examination, modified KOH microscopic examination, morphological observation, TTC chromogenic culture, histologic section technique, and nested PCR technique. The positive rates of detected samples by methods above were 62.0%(31/50), 78.0%(39/50), 82.0%(41/50), 82.0%(41/50), 86%(43/50) and 88.0%(44/50), and the time drains were 1-2 hours(h), 1-2 h, 7-8 d, 6-7 d, 8-10 d and 7-8 h, respectively. By comparison of merits and demerits between different methods, a proposal of combining the nested PCR test with the modified microscopic examination is presented as a preferred embodiment for handy and quick diagnosis of candidiasis albicans in broiler chicken, which has advantages including high specificity and sensitivity, less time consumption and taking account of visualizability of the invasive pathogen.

broiler chicken;Candidaalbicans; diagnosis methods; nested PCR

Liu Yan-wei, Email: liuyw.edu@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.12.013

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.C2015402157)

劉彥威，Email：liuyw.edu@126.com

河北工程大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，邯鄲 056021

R378.99;S854.4

A

1002-2694(2015)12-1151-06

2015-05-20；

2015-09-03

Supported by the Natural Science Foundation of Hebei Province in China (No. C2015402157)