何文兵,慈 慧,張美娟
(1.通化師范學(xué)院 制藥與食品科學(xué)學(xué)院,吉林 通化 134002;2.通化師范學(xué)院長白山食品工程研究中心,吉林 通化 134002;
3.通化市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,吉林 通化 134002)
東北朝鮮族泡菜中乳酸菌的分離鑒定*
何文兵1,2,慈 慧3,張美娟1
(1.通化師范學(xué)院 制藥與食品科學(xué)學(xué)院,吉林 通化 134002;2.通化師范學(xué)院長白山食品工程研究中心,吉林 通化 134002;
3.通化市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所,吉林 通化 134002)
以朝鮮族泡菜為原料從中篩選乳酸菌,通過對形態(tài)特征、生理生化等進(jìn)行初步鑒定,從中篩選出15株乳酸菌,以產(chǎn)酸速度快、亞硝酸鹽降解能力強(qiáng)等指標(biāo)為依據(jù),優(yōu)選出發(fā)酵性能好的5株乳酸菌:LB5、LB6、LB7、BC6、BC8.
乳酸菌;分離;鑒定
泡菜是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵制品,不同地域的產(chǎn)品不同,國內(nèi)尤以四川泡菜為典型,而東北地區(qū)的泡菜則以朝鮮族泡菜最具代表性.現(xiàn)代微生物學(xué)的發(fā)展, 進(jìn)一步揭示了乳酸菌對人體健康有益作用的機(jī)理[1],使用乳酸菌發(fā)酵加工的泡菜引起了國內(nèi)外研究人員的重視.在泡菜的發(fā)酵過程中乳酸菌優(yōu)越的發(fā)酵性能夠縮短發(fā)酵的時間、提高泡菜的品質(zhì)、延長泡菜食用期,同時在降低亞硝酸鹽含量、防腐抑菌等方面都有重要作用[2].本試驗以朝鮮族泡菜“金剛山泡菜”為原料,研究東北地區(qū)朝鮮族泡菜中乳酸菌的多樣性,從中分離篩選優(yōu)勢乳酸菌,并結(jié)合當(dāng)?shù)氐馁Y源優(yōu)勢,應(yīng)用到長白山區(qū)山野菜泡菜產(chǎn)品的開發(fā)中,實現(xiàn)長白山地區(qū)山野菜資源的深加工,促進(jìn)當(dāng)?shù)刭Y源優(yōu)勢的有力轉(zhuǎn)化,服務(wù)地方經(jīng)濟(jì).
1.1 材料
LB:“金剛山”朝鮮族蘿卜泡菜;BC:“金剛山”朝鮮族白菜泡菜.
1.2 藥品及儀器
酵母膏,蛋白胨,酵母浸粉,牛肉浸粉,葡萄糖,檸檬酸二銨,硫酸鎂,瓊脂粉,磷酸氫二鉀,硫酸錳,乙酸鈉,吐溫80,碳酸鈣,亞硝酸鈉,氯化銨,乙酸,對氨基苯磺酸,鹽酸萘乙二胺,葡萄糖,無水碳酸鈣, 95%乙醇,氯化鈉,鹽酸,三氯化鐵;(以上化學(xué)試劑均為分析純).
精密酸度計,NOSHP0101239131 (上海大譜儀器有限公司);電子天平,MPZ1001 (上海恒平科學(xué)儀器有限公司);凈化工作臺,CWCJ-CJ系列 (上海恒平科技有限公司);生化培養(yǎng)箱SPX-100B-2 (上海博迅實業(yè)有限公司);生物顯微鏡,B203LED (重慶奧特光學(xué)儀器有限公司);離心機(jī) TDL80-213(上海安享科學(xué)儀器廠制造);立式壓力蒸汽滅菌器 TDL80-2B(上海博迅實業(yè)有限公司);空氣恒溫?fù)u床 KYC-100C(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);干燥箱DHG-9245A型(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);生化培養(yǎng)箱SPX-150B-Z (上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);低溫冰箱BCD-186D (合肥美菱股份有限公司);722分光光度計.
1.3 培養(yǎng)基的配制
MRS固體培養(yǎng)基[3]:蛋白胨 10g;牛肉浸粉 10g;酵母浸粉 5g;葡萄糖 20g;檸檬酸二銨2g;硫酸鎂0.58g;磷酸氫二鉀2g;硫酸錳0.25g;乙酸鈉5g;吐溫801mL;瓊脂粉15g;蒸餾水1000mL.調(diào)pH值6.2~6.4,121℃滅菌15min.MRS液體培養(yǎng)基[3]:蛋白胨 10g;牛肉浸粉 10g;酵母浸粉 5g;葡萄糖 20g;檸檬酸二銨2g;硫酸鎂0.58g;磷酸氫二鉀2g;硫酸錳0.25g;吐溫801mL;乙酸鈉5g;蒸餾水1000mL.調(diào)pH值6.2~6.4,121℃滅菌15min.
2.1 乳酸菌分離純化及保藏
其流程為:泡菜樣品→乳酸菌分離→純化→乳酸菌的形態(tài)鑒定→生理生化鑒定→斜面保藏→增殖培養(yǎng)→亞硝酸的降解率→產(chǎn)酸定性鑒定→菌種保藏[4].以無菌操作,定量稱取泡菜及汁,勻漿后放在滅菌的試管中用無菌水進(jìn)行梯度稀釋,選取適宜的稀釋度,取1mL于培養(yǎng)皿中,以滅菌的45~50℃的加有2%CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基傾倒平板,于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48h,挑取有溶鈣圈的黃色單菌落,具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進(jìn)行反復(fù)分離、純化至純菌落.將各菌株編號、保存待鑒定.
2.2 乳酸菌的鑒定
(1)乳酸菌的初步鑒定.形態(tài)鑒定方法[3,4]:取保存編號乳酸菌分別接種到MRS平板培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48h,取典型的菌落做革蘭氏染色,用顯微鏡觀察菌體特征.
生理生化試驗[5]:鑒定方法,觸酶試驗,用接種環(huán)挑取細(xì)菌置于潔凈的載玻片上,滴加3%~15%的過氧化氫溶液1滴,立即觀察結(jié)果,若有氣泡產(chǎn)生則細(xì)菌為陽性,若無氣泡產(chǎn)生則細(xì)菌為陰性.對革蘭氏染色陽性、觸酶試驗陰性的菌落繼續(xù)于4℃條件下保藏.該環(huán)節(jié)以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌做對照.
(2)產(chǎn)酸速度實驗[6].pH法測定產(chǎn)酸速度:取初步篩選完的乳酸菌活化后,用接種環(huán)輕輕挑一環(huán)接入已滅菌的10mL MRS液體培養(yǎng)基中,于30℃下震蕩培養(yǎng)18h后,按1%的接種量取此菌懸液0.5mL接入50mL已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中,于30℃下震蕩培養(yǎng),并每隔2h取樣5mL測定其pH值,考察其對葡萄糖的發(fā)酵產(chǎn)酸作用.
(3)亞硝酸鹽降解實驗.分別吸取0、0.20、0.40、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50mL NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液(相當(dāng)于0μg、1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、7.5μg、10μg、12.5μg NaNO2),分別置于50mL比色管中.在標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液管中分別加入2mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3~5min后各加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g·L-1),加水至刻度,混勻,靜置15min,用2cm比色杯,以零管調(diào)節(jié)零點,于波長538nm處測吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.取初步篩選完的乳酸菌活化后接入已滅菌的10mL MRS液體培養(yǎng)基中,于30℃下震蕩培養(yǎng)18h后,按1%的接種量取此菌懸液1mL分別接入100mL已滅菌的含有NaNO2(10mg·L-1)的MRS液體培養(yǎng)基中,于30℃震蕩培養(yǎng)72h.將含菌體的培養(yǎng)基用高速離心機(jī)3500r/s離心兩次,每次10min以去除菌體.采用鹽酸萘乙二胺法測定其亞硝酸鹽含量.
鹽酸萘乙二胺法[7]:吸取40mL上述濾液于50mL比色管中,加入2mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液搖勻.靜置3~5min后,加入1mL 0.2%的鹽酸萘乙二胺溶液,并用蒸餾水定容到50mL,搖勻靜置15min后用分光光度計在538nm波長下測定吸光度,同時以不加NaNO2且不接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基為對照.
表1 革蘭氏染色結(jié)果
3.1 乳酸菌的分離純化結(jié)果
從金剛山朝鮮族蘿卜泡菜中分離出7株乳酸菌,分別命名為LB1、LB2、LB3、LB4、LB5、LB6、LB7;從金剛山朝鮮族白菜泡菜中分離出8株乳酸菌,分別命名為BC1、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8.
3.2 革蘭氏染色結(jié)果
乳酸菌涉及到乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬等,其形態(tài)特征為革蘭氏染色陽性、無鞭毛.基于顯微鏡下菌體的顏色及形態(tài),上述分離到的微生物初步被定性為乳酸菌(表1、圖1).
圖1 不同來源的乳酸菌菌株油鏡觀察
3.3 接觸酶反應(yīng)結(jié)果[3]
分別對15個菌株進(jìn)行接觸酶實驗,觀察其是否產(chǎn)生氣體,并以此判定接觸酶實驗結(jié)果.
表2 接觸酶實驗結(jié)果
由表2可知,LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC2、BC3、BC4、BC5、BC6、BC7、BC8均為接觸酶陰性,符合乳酸菌的特性,所以將以上菌株保留.
3.4 產(chǎn)酸實驗結(jié)果
圖2 產(chǎn)酸速率曲線
由圖2可知,在12h的檢測中發(fā)現(xiàn),pH值變化幅度較大的發(fā)酵液其菌種的產(chǎn)酸能力相對較強(qiáng),即LB3、LB4、LB5、LB6、LB7、BC5、BC6、BC8產(chǎn)酸速率較好.其中由于BC2,BC3產(chǎn)酸速率不理想,所以將其淘汰.
3.5 亞硝酸鹽鹽降解結(jié)果
圖3 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線
亞硝酸鹽含量在0~14ug之間,吸光度在0~0.2之間,據(jù)此繪制亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3).通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的亞硝酸鹽含量.降解率等于培養(yǎng)基中NaNO2減少的量/10mg·L-1與未接菌的培養(yǎng)基中的NaNO2的含量/10mg·L-1之比乘100%.
表3 亞硝酸鹽降解率(%)
由表3可知,LB5、LB6、LB7、BC6、BC8的亞硝酸鹽降解率較好,其中LB3、LB4、LB6、BC5由于亞硝酸鹽降解率不好,所以將其淘汰.
經(jīng)革蘭氏染色、形態(tài)鑒定、接觸酶反應(yīng)等試驗,從朝鮮族金剛山泡菜中分離到15株乳酸菌菌株,并以產(chǎn)酸速率,亞硝酸鹽降解能力等為指標(biāo)從中優(yōu)選出5株乳酸菌分別命名為LB5、LB6、LB7、BC6、BC8.同時發(fā)現(xiàn)來源于辣白菜中的菌株以球菌為主,而酸蘿卜中的乳酸菌以桿菌為主,表明不同的乳酸菌對底物的營養(yǎng)要求有區(qū)別.
作為優(yōu)化篩選的這5株乳酸菌將對其進(jìn)行后續(xù)的深入研究,并將其應(yīng)用到山野菜泡菜的發(fā)酵試驗,以考察其對原料的適應(yīng)性,為后續(xù)產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ).
[1]Cherl- Ho L. Lactic acid fermented foods and their benefits in Asia[J]. Food Control, 1997, 8(5-6):259-269.
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(責(zé)任編輯:陳衍峰)
10.13877/j.cnki.cn22-1284.2015.04.004
2014-11-21
吉林省科技發(fā)展計劃項目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究及生產(chǎn)應(yīng)用”(2013419008CB);吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究”(吉教科合字[2013]第495號);通化師范學(xué)院校級項目“長白山山野菜泡菜生產(chǎn)加工關(guān)鍵技術(shù)研究”(201270)
何文兵,吉林九臺人,在讀博士,副教授.
Q93
A
1008-7974(2015)02-0011-03