廖烈君 尹利君 曾麒燕

(廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

論 著

兩種用FITC標(biāo)記紅桂木凝集素方法的比較*

廖烈君 尹利君 曾麒燕△

(廣西醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣西 南寧 530021)

目的：紅桂木凝集素(Artocarpus lingnanensis lectin，ALL)與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)方法的探究。方法：分別采用透析法和固化法使FITC與紅桂木凝集素偶聯(lián)，檢測(cè)偶聯(lián)物的F/P值。結(jié)果：固相化法的F/P值達(dá)1.02，其它方法F/P值約為0.758。結(jié)論：采用固化法使FITC標(biāo)記紅桂木凝集素，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，方法穩(wěn)定可靠，且可獲得較高偶聯(lián)率的紅桂木凝集素偶聯(lián)異硫氰酸熒光素(ALL-FITC)利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

FITC；凝集素；透析；濃縮

凝集素是一類(lèi)能與糖類(lèi)特異性結(jié)合并能使細(xì)胞凝集的蛋白質(zhì)或糖蛋白[1-2]。它能與糖專一地、非共價(jià)地可逆結(jié)合，并具有凝集細(xì)胞和沉淀聚糖或糖復(fù)合物的作用，而細(xì)胞表面糖鏈物在細(xì)胞癌變、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中都起著重要作用[3-4]。因此近年來(lái)，凝集素漸漸成為研究細(xì)胞生物膜表面性質(zhì)變化的重要探針。為更好的開(kāi)展紅桂木凝集素(Artocarpus lingnanensis lectin，ALL)作為分子探針的研究和進(jìn)一步研究紅桂木凝集素受體在腫瘤細(xì)胞上的分布情況，需要建立用熒光素標(biāo)記紅桂木凝集素的方法。凝集素與異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)結(jié)合的方法文獻(xiàn)報(bào)道中主要有透析法和固化法，且結(jié)合物的F/P值有較大的不同[5]。目前還未有FITC標(biāo)記ALL的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)透析法和固化法用FITC標(biāo)記紅桂木凝集素的效果進(jìn)行探索研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

純化的ALL，為本課題組制備；FITC(F7250，美國(guó)Sigma公司)；透析袋(分子量10000)(美國(guó)Sigma公司)；半乳糖(美國(guó)Sigma公司)；Sepharose 4B(美國(guó)Pharmacia公司)；DAPI(瑞士羅氏公司)；BCA蛋白試劑盒(中國(guó)碧云天公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。DAPI班氏試劑(無(wú)水硫酸銅1.47g，溶于100 ml熱水中，冷卻后稀釋到150 ml，取檸檬酸鈉173 g，無(wú)水碳酸鈉100 g和600 ml水共熱，溶后冷卻定容850 ml，再與150 ml硫酸銅混勻即可)；PBS(pH7.2)緩沖液(自配)。激光共聚焦顯微鏡尼康NIKONA1。

1.2 方法

1.2.1 透析法制備FITC-ALL

1.2.1.1 交聯(lián)

將5 mg紅桂木凝集素凍干粉溶于5 ml的0.15 mol·L-1磷酸二氫鈉，pH9.0溶液，稱取100 μgFITC，在4℃條件下緩慢加入上述溶液中，混合均勻，置于搖床上避光4℃反應(yīng)20 h。

1.2.1.2 純化偶聯(lián)物

將偶聯(lián)物FITC-ALL在PBS緩沖液中充分透析，至透析液由黃綠色變透明清亮為止，透析過(guò)程4℃避光。偶聯(lián)物置于4℃避光保存。

1.2.1.3 偶聯(lián)物F/P值測(cè)定

測(cè)定偶聯(lián)物FITC-ALL的A495查FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線得其FITC的濃度，用BCA蛋白試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定ALL的濃度，代入以下公式：

1.2.2 固化法制備FITC-ALL

1.2.2.1 ALL固相化-親和吸附

稱取紅桂木凝集素30 mg溶于5 mlPBS中，BCA蛋白試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出該溶液中蛋白質(zhì)濃度及蛋白質(zhì)總量，加30 mlSepharose4B(預(yù)先經(jīng)PBS浸泡)混勻，置于4℃冰箱過(guò)夜。次日，吸取上清液，用少量PBS洗Sepharose4B 3次；合并各次上清液，BCA蛋白試劑盒做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算上清液中蛋白質(zhì)含量，代入下列公式，得到紅桂木凝集素吸附率為82%。

1.2.2.2 ALL與FITC結(jié)合

稱取FITC 500 μg，溶于PBS 1 ml，逐滴加入ALL-Sepharose4B中，混勻，輕搖20 min避光4℃放置6 h。然后裝入層析柱，避光。柱用PBS洗，直至洗出液無(wú)明顯熒光為止。再改用0.2 mol·L-1Gal 0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)緩沖液(含0.1 mol·L-1NaCl)溶液洗脫結(jié)合于Sepharose4B上的ALL-FITC，分試管收集，合并有熒光部分的洗脫液。

1.2.2.3 純化偶聯(lián)物

將偶聯(lián)物FITC-ALL在PBS緩沖液中充分透析，去除半乳糖后(用班氏試劑檢測(cè))，避光4℃保存。

1.2.2.4 ALL-FITC質(zhì)量鑒定

1.2.3 染色

胃癌石蠟切片置于60℃烘箱烤片1 h，二甲苯脫蠟兩次各10 min，梯度酒精水化各5 min，PBS(pH7.2)緩沖液搖床震洗3次各3 min，加入FITC-ALL適量(完全覆蓋組織)，4℃避光靜置4 h，后用PBS(pH7.2)緩沖液洗3次，每次3 min，加入0.1 ug·ml-1DAPI適量(完全覆蓋組織)，4℃避光靜置30 min，在激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

2 結(jié)果

透析法測(cè)得F/P值為0.758，固相化法測(cè)得F/P值為1.02。在熒光標(biāo)記紅桂木凝集素的方法中，固相化法較第一種方法偶聯(lián)效果好。但用兩種方法制備的FITC-ALL染胃癌切片均得到較好的效果，見(jiàn)圖1。

(a)固化法制備的FITC-ALL

(b)透析法制備的FITC-ALL

3 討論

凝集素是一類(lèi)不同于免疫球蛋白的蛋白質(zhì)或糖蛋白，在生物界中分布廣泛，幾乎存在于各種有機(jī)體，它們的存在調(diào)節(jié)著許多生物學(xué)過(guò)程。凝集素能與糖專一地、非共價(jià)地可逆結(jié)合，這種結(jié)合的能力與配體和受體的結(jié)合特性一致，因而就把這種能與之相應(yīng)的凝集素特異性親和的糖類(lèi)稱之為凝集素結(jié)合受體[6]。這類(lèi)結(jié)合受體多存在于細(xì)胞膜表面和胞質(zhì)，利用凝集素可與其受體特異性結(jié)合的這一特性，能夠分離純化這些細(xì)胞膜和胞漿上的糖蛋白或糖脂，并對(duì)這些糖蛋白或糖脂進(jìn)行研究。由于凝集素這一特異性的識(shí)別功能，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者都非常重視利用凝集素作為探針，以區(qū)別正常組織細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。用標(biāo)記凝集素作為探針成為了研究腫瘤細(xì)胞上能和凝集素特異性結(jié)合的蛋白或糖脂的重要手段。凝集素由于具有多價(jià)結(jié)合能力，能與酶、熒光素、生物素、膠體金、鐵蛋白等結(jié)合而不影響其生物學(xué)活性，因此，凝集素可用于免疫細(xì)胞化學(xué)的研究，以及腫瘤的診斷評(píng)價(jià)等；目前最常用的方法之一就是用熒光標(biāo)記，標(biāo)記凝集素為研究體內(nèi)各種糖基化機(jī)制和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，同時(shí)了增強(qiáng)了研究結(jié)果的動(dòng)態(tài)性[7]。

根據(jù)文獻(xiàn)[5]本實(shí)驗(yàn)所用ALL提取純化時(shí)采用的是0.01 mol·L-1PBS(pH7.2)緩沖液透析，所以透析法采用同樣的PBS透析，以達(dá)到去除未結(jié)合的FITC純化偶聯(lián)物的目的，但透析法在去除未結(jié)合的FITC時(shí)并不能同時(shí)去除未反應(yīng)的ALL，所以實(shí)驗(yàn)所需FITC的量需要絕對(duì)大于將與ALL結(jié)合的量，造成試劑的浪費(fèi)。固化法的優(yōu)點(diǎn)是使ALL親和吸附于Sepharose4B使之固化，保護(hù)了ALL與糖反應(yīng)的基團(tuán)，使ALL在反應(yīng)過(guò)程中保持性質(zhì)穩(wěn)定，不易失去活性，且ALL活性受FITC量、反應(yīng)溫度及時(shí)間影響小。Sepharose4B吸附ALL是有活性的分子，原料中無(wú)活性或活性低的分子及反應(yīng)中失去活性的分子，均隨溶液流出，達(dá)到分離的目的。固化法所制備出的偶聯(lián)物F/P值達(dá)1.02，重復(fù)性好；透析法方法簡(jiǎn)便但制備的偶聯(lián)物F/P值較低，且透析時(shí)不能同時(shí)去除未反應(yīng)的ALL，若有ALL殘留則可能使F/P值偏小，這也可能是透析法制備的偶聯(lián)物F/P值較低的原因之一，所造成的實(shí)驗(yàn)誤差較大。

凝集素由于其特異性的糖結(jié)合活性等特點(diǎn)，在許多生物學(xué)過(guò)程中均發(fā)揮著重要的作用[7]。傳統(tǒng)的研究重點(diǎn)是對(duì)其的分離純化以及一般性質(zhì)的研究上，隨著分子生物學(xué)、生物技術(shù)等方面的實(shí)驗(yàn)手段的發(fā)展，對(duì)凝集素的研究將著重于對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能以及如何應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)方面。標(biāo)記凝集素為這一研究方向提供了可行性，本實(shí)驗(yàn)作為初步的開(kāi)始，還需更多的優(yōu)化使熒光標(biāo)記凝集素成為研究糖復(fù)合物在生理及病理?xiàng)l件下是如何發(fā)揮其作用的有力工具。

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Comparison study of two methods labeling ALL with FITC*

Liao Lie-Jun,Yin Li-Jun,Zeng Qi-Yan△

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Guangxi Medical University, Guangxi Nanning 530021)

Objective：To investigate the method of labeling artocarpus lingnanensis lectin(ALL) with FITC. Methods: It was calculated separately the ratio of FITC to artocarpus lingnanensis lectin(ALL) of the FITC-labeled ALL made by dialysis method and solidification method. Results: The F/P ration of FITC-labeled ALL made by solidification method was 1.02, the F/P ration of FITC-labeled ALL made by dialysis was 0.758. Conclusions: Both of the two methods of labeling ALL with FITC were successful, the solidification method is better than dialysis method.

FITC; Lectin; Dialysis; Solidification

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81160366)，廣西自然科學(xué)基金(桂科攻10124001A-23)

廖烈君，女，在讀碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究，Email：83424777@qq.com。

△通訊作者：曾麒燕，女，教授，主要從事腫瘤免疫方面的研究，Email：zqy2002422@qq.com。

2014-12-19)