黃秋玲等

[摘要] 目的 了解湖州市2013～2014年手足口病病原構(gòu)成及其臨床相關(guān)特征。 方法 采集208例疑似手足口病感染者的253份標(biāo)本（咽拭子45份和糞便208份）和相關(guān)臨床資料，采用一步法三色熒光定量RT-PCR檢測臨床樣本。 結(jié)果 一步法熒光定量RT-PCR檢測表明，208例手足口病患兒中，EV的檢出率為83.17%（173/208），其中EV71、CoxA16和其他EV亞型所占EV的比例分別為55.49%、13.29%和31.21%，且男、女患兒之間的檢測結(jié)果并無顯著差異。5歲及以下（≤5歲）手足口病患兒中，主要的病原為EV71，而5歲以上以其他EV亞型為主；臨床癥狀以發(fā)熱伴皰疹為手足口病的主要癥狀，而引起發(fā)熱伴嘔吐、皰疹或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的主要腸道病毒為EV71。此外糞便樣本的EV檢出率高于咽拭子樣本的EV檢出率。 結(jié)論 腸道病毒EV71和其他EV亞型是湖州市兒童手足口病的優(yōu)勢病原體，而CoxA16病毒呈現(xiàn)下降趨勢，因此加強(qiáng)EV、EV71和CoxA16的監(jiān)測有助于更好地預(yù)防和控制手足口病。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。荒c道病毒71型；柯薩奇病毒A16型

[中圖分類號] R512.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2015）13-0044-03

[Abstract] Objective To explore the pathogens and clinical characterization of hand， foot and mouth disease （HFMD） in Huzhou city from 2013 to 2014. Methods All 253 specimens included 208 stool specimens and 45 throat swabs， and clinical data from 208 children cases with hand， foot and mouth diseases（HFMD） were collected. Preliminary detection for all of the specimens was performed by one-step triple real-time RT-PCR assay. Results Real-time RT-PCR assay indicated that the positive rate of Enterovirus（EV）from 208 cases was 83.17% （173/208）， and the percentages of EV71， CoxA16 and others EV subtypes in 173 enteroviruses were 55.49%， 13.29% and 31.21%， respectively. These results were not significant differences between male and female children. EV71 from children with HFMD was predominant strain below 5 old years （≤5）， and others EV subtypes were predominant strains over 5 years （>5）. Of fever with herpes was main clinical symptom in patients with HFMD， and EV71 was primary enterovirus induced many clinical features， such as fever with herpes or vomiting or neurological symptoms and so on. Additionally， detection rate of EV in stool specimens was significant higher than that in throat swabs. Conclusion EV71 and others EV subtypes are predominant strains， CoxA16 strains have a downtrend in patients with HFMD in Huzhou city， so that the medical workers should improve the ability of surveillance to EV，EV71 and CoxA16 in order to make better for control and prevention of the HFMD diseases.

[Key words] Hand， foot and mouth disease； Enterovirus 71； Coxsackie A16

手足口?。╤and， foot and mouth disease， HFMD）是由多種腸道病毒（enterovirus， EV）引起的常見傳染病，多發(fā)于嬰幼兒。大多數(shù)患者臨床癥狀較輕，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹等癥狀，個別患者可引起心肌炎、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥[1，2]。該病一般由腸道病毒71型 （EV71）、柯薩奇病毒 （Cox）A4、A5、A16和B1、B3等腸道病毒引起，EV71和CoxA16 型最為常見[2，3]。

EV71和CoxA16感染所引起的手足口病在臨床上難以區(qū)別，特別是EV71能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，而且近年來，EV71在亞太地區(qū)的流行呈上升趨勢，并出現(xiàn)死亡病例，由于CoxA16與心肌炎、心包炎等疾病相關(guān)而逐漸受到重視[4，6]。

為了解湖州市區(qū)手足口病的情況，我們收集了2013年5月～2014年7月期間共208例疑似手足口病感染者的253份不同類型的標(biāo)本和相應(yīng)的臨床資料，采用一步法三色熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行初步檢測分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

根據(jù)《手足口病診療指南（2013年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，從湖州市中心醫(yī)院和湖州市第一人民醫(yī)院采集208例臨床初步診斷為手足口病感染者的253份標(biāo)本（咽拭子45份和糞便208份），其中男116例，女92例，年齡10個月～7歲，平均（2.65±1.56）歲。同時收集患者相應(yīng)的臨床資料，標(biāo)本采集后置-80℃冰箱凍存待檢。

1.2 試劑和儀器

QIAamp Viral RNA Mini Kit（Cat：57704）病毒RNA核酸提取試劑盒購自Qiagen公司，手足口病EV71、CA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）（HRP0011）購自江蘇默樂生物科技有限公司，ABI7500 PCR儀為美國ABI公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 RNA核酸提取 根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit的操作說明書提取臨床采集樣本的RNA核酸，收集RNA提取液終體積為50μL，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 一步法熒光定量RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)手足口病EV71、CA16及通用型腸道病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR法）的操作說明書進(jìn)行試劑的配置和核酸檢測。簡要說明如下：反應(yīng)體系為：RT-PCR 緩沖液為12.5 μL，Taq酶0.5 μL，RT酶0.5 μL，引物和探針6.5 μL，核酸5 μL；一步法RT-PCR擴(kuò)增條件：45℃ 15 min，95℃ 2 min，40個循環(huán)（94℃ 10 s，60℃10 s）。熒光信號的收集定為FAM（腸道病毒）、ROX（CoxA16）、HEX（EV71），數(shù)據(jù)的采集設(shè)在60℃。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。不同年齡、性別、臨床癥狀和樣本類型等資料采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同性別和年齡患兒的病原分析

對208例臨床診斷為手足口病感染的患兒標(biāo)本進(jìn)行一步法熒光定量RT-PCR檢測，EV的檢出率為83.17%（173/208），其中EV71所占EV的比例最高為55.49%（96/173），而其他EV亞型的比例（31.21%，54/173）也明顯高于CoxA16的比例（13.29%，23/173）。

116例男性和92例女性患兒中，EV的檢出率分別為81.03%（94/116）和85.87%（79/92）；其中以EV71所占比例最高，分別為58.51%（55/94）和51.90%（41/79）；而CoxA16所占比例為最低，分別為11.70%（11/94）和15.19%（12/79）；其他EV亞型的比例分別為29.79%（28/94）和32.91%（26/79）。見表1。

此外，在5歲及以下（≤5歲）和5歲以上（>5歲）的患兒中，EV的檢出率分別為86.81%（158/182）和57.69%（15/26）；其中EV71所占的比例分別為55.70%（88/158）和33.33%（5/15）；其他EV亞型的比例分別為30.38%（48/158）和60.00%（9/15）；而CoxA16所占比例為最低，分別為13.92%（22/158）和6.67%（1/15）。見表1。

2.2 不同臨床癥狀中的病原分析

208例患兒中，多數(shù)患兒出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，其中發(fā)熱伴皰疹最多為112例，其次發(fā)熱伴嘔吐有36例，發(fā)熱伴神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有26例，其他情況有34例；引起患兒出現(xiàn)發(fā)熱伴皰疹癥狀的主要病原為EV71（58.42%，59/101），其次為其他EV亞型病毒（26.73%， 27/101），而CoxA16最少（14.85%，15/101）；引起患兒出現(xiàn)發(fā)熱伴嘔吐癥狀的主要病原為EV71（56.67%，17/30）；引起患兒出現(xiàn)發(fā)熱伴神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的主要病原為EV71（72.22%，13/18）；引起患兒出現(xiàn)不典型的其他癥狀的主要病原為其他EV亞型病毒（62.5%，15/25）。見表2。

2.3 不同樣本的病原分析

253份臨床標(biāo)本中，208份糞便中EV的檢出率為76.92%（160/208）。其中EV71、CoxA16和其他EV亞型的所占比例分別為52.50%（84/160）、14.38%（23/160）和33.13%（53/160）；45份咽拭子中EV的檢出率為51.11%（23/45），其中EV71所占比例最高為65.22%（15/23），其次是其他EV亞型為26.09%（6/23），CoxA16所占比例最低為8.70%（2/23）。見表3。

3 討論

手足口病是由多種腸道病毒引起的小兒常見傳染病。腸道病毒屬于小RNA病毒科，根據(jù)血清學(xué)可分為柯薩奇、?？刹《?、脊髓灰質(zhì)炎病毒和腸道病毒68-71型等，共67個血清型[2，3，7]，其中尤以EV71和CoxA16型最為常見。

本次研究中，208例疑似手足口病患兒中，一步法熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，EV71陽性病例數(shù)占腸道病毒的比例與近年杭州報道的結(jié)果相一致[8]。而其他EV亞型（即非EV71和非CoxA16）的陽性百分比顯著高于CoxA16的比例，這些結(jié)果表明EV71的流行仍是引起手足口病的主要病原，但其他EV亞型的流行趨勢有所升高，值得密切關(guān)注，并與國內(nèi)其他地區(qū)的報道基本一致[9]。

不同年齡患兒的檢測結(jié)果顯示，疑似手足口病患兒的感染以5歲以下兒童為主，顯著高于5歲以上患兒。5歲以下患兒EV71的檢出百分比顯著高于CoxA16和其他EV亞型，而5歲以上患兒其他EV亞型檢出百分比最高。此外手足口病患兒的感染雖然無男女性別的顯著差異，但其他EV的檢出百分比顯著高于浙江湖州地區(qū)的相關(guān)報道[10]，與國內(nèi)外其他地區(qū)的報道基本一致[11-13]。

手足口病患兒的臨床診斷主要根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行初步診斷，我們的結(jié)果表明，發(fā)熱伴皰疹癥狀仍然是主要的臨床癥狀，EV71是引起發(fā)熱伴皰疹癥狀的主要病原，其次是其他EV亞型的腸道病毒，而CoxA16病毒相對較少。手足口病的傳播主要通過糞-口和（或）密切接觸傳播，患者的咽拭子和糞便中均可檢測出EV71、CoxA16和其他EV亞型的腸道病毒。Ooi MH等[14]研究表明，不同的臨床標(biāo)本對手足口病相關(guān)的腸道病毒的檢出有著一定的差別，在潛伏期可通過患者的糞便和咽拭子標(biāo)本檢測到腸道病毒[14]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在咽拭子和糞便樣本中均檢測出腸道病毒。糞便中EV71的檢出率高于咽拭子樣本，但CoxA16和其他EV亞型的檢出率在咽拭子和糞便樣本中并無顯著差異，表明EV71型病毒的活躍程度較強(qiáng)；與國內(nèi)相關(guān)的報道存在一定差異[9-11，15]。

以上分析表明，由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，體內(nèi)并無相應(yīng)的保護(hù)性抗體，從而導(dǎo)致機(jī)體的抵抗力相對較差，容易受到腸道病毒的感染。由EV71、CoxA16和其他EV亞型的腸道病毒引起的手足口病在不同地區(qū)、不同年份間的發(fā)病率存在一定的差異，不同年齡、不同的樣本類型和采樣時間也可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果存在一定的偏差，因此需要根據(jù)患兒的病情采集合適的標(biāo)本類型，密切地對嬰幼兒特別是5歲以下嬰幼兒進(jìn)行腸道病毒的病原學(xué)檢測和分型。

手足口病的治療目前尚無特效的抗病毒治療藥物，因此加強(qiáng)對腸道病毒特別是EV71和CoxA16及其他EV亞型的監(jiān)測和鑒別診斷，使臨床醫(yī)生能夠早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，對于預(yù)防控制手足口病的流行和暴發(fā)至關(guān)重要。

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（收稿日期：2014-12-30）