吳 浩，韓紅娟，任小華，梁 琳

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.口腔科，b.藥學部，四川 成都 610072)

缺氧對成牙骨質(zhì)細胞增殖、凋亡及缺氧相關基因的影響

吳 浩a，韓紅娟a，任小華a，梁 琳b

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院 a.口腔科，b.藥學部，四川 成都 610072)

目的 探討不同時間缺氧微環(huán)境對成牙骨質(zhì)樣細胞OCCM-30增殖、凋亡及缺氧相關基因的影響，了解缺氧在正畸導致的牙骨質(zhì)吸收中所起的作用。方法 利用三氣培養(yǎng)箱構建細胞缺氧模型，以常氧條件培養(yǎng)為對照組，利用MTT法測定細胞增殖率，流式細胞術檢測細胞凋亡率，RT-PCR檢測HIF-1α、VEGF mRNA等相關基因的表達變化。結果 缺氧可以抑制OCCM-30細胞的增殖，明顯提高細胞的凋亡率，并能顯著誘導HIF-1α和VEGF mRNA基因的表達，HIF-1αmRNA的表達水平在24 h達到頂峰后進入平臺期；而VEGF mRNA的表達水平在36 h后開始逐步上調(diào)。結論 缺氧微環(huán)境能抑制OCCM-30細胞增殖，促進調(diào)亡及缺氧相關基因的表達。

缺氧；成牙骨質(zhì)樣細胞；OCCM-30；增殖；HIF-1α

正畸矯治過程中，施加于牙齒上的矯治力使牙周組織產(chǎn)生相應的組織改建，從而使牙齒移動。機械張/壓應力和氧分壓的下降是牙周系統(tǒng)在正畸矯治過程中受到的主要外界刺激，以前的研究大多關注機械張/壓應力對其相關功能的調(diào)節(jié)。相關研究表明，缺氧微環(huán)境對成骨細胞和破骨細胞的功能均有很大的影響[1]。正畸能導致牙周血管變化，在牙周形成局部缺氧環(huán)境，正畸牙周改建中也起著同樣重要的作用。本文擬對缺氧環(huán)境對成牙骨質(zhì)細胞增殖、凋亡及缺氧相關基因的影響作初步的探討，為正畸臨床提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本實驗所使用的細胞為美國華盛頓大學Somerman教授實驗室提供的成牙骨質(zhì)樣細胞株OCCM-30。相關研究表明，OCCM-30細胞的主要性能完全符合成牙骨質(zhì)細胞功能特點，是成熟、穩(wěn)定的成牙骨質(zhì)細胞株體系，能作為研究成牙骨質(zhì)細胞相關調(diào)控功能的模型[2]。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞缺氧 采用德國Binder三氣培養(yǎng)箱，通過控制N2的輸入量，用傳感器來實現(xiàn)對O2濃度的實時精確控制。將細胞按1×105個/毫升接種于中號培養(yǎng)瓶(50 ml)內(nèi)，每瓶2 ml，鏡下觀察細胞大部分貼壁后(約12 h)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至三氣缺氧箱內(nèi)，當氧氣濃度降至預設濃度時(大約1～2小時)，開始計時。缺氧組條件設置：2%O2、5%CO2、93%N2；對照組培養(yǎng)條件：20%O2、5%CO2、75%N2(細胞正常培養(yǎng)條件)。檢測時間點：0、6、12、24、36、48、72 h。缺氧完成后按檢測手段分別收集細胞。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖率 按時間點收集細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度為1×104個/毫升，于96孔板每孔加入200 μl，一段時間后每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4小時后吸棄液體，每孔加入DMSO 200 μl，震蕩15分鐘，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570 nm波長，設立不含任何細胞的空白對照孔調(diào)零，測定每孔的光密度值(OD值)。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集缺氧干預后的細胞，75%酒精調(diào)整細胞密度，在4 ℃環(huán)境下固定24小時。制作碘化吡啶(PI)溶液：將PI溶于中性PBS中，并調(diào)整終濃度為100 μg/ml，4 ℃冰箱中棕色瓶避光保存。將固定好的細胞離心5分鐘后棄去液體，PBS重懸5分鐘，400目濾網(wǎng)過濾1次除雜質(zhì)，4 ℃冰箱中避光30分鐘，流式細胞儀檢測并進行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測HIF-1α、VEGF mRNA的表達

引物由寶生物公司代為合成及測試。HIF-1α 正向引物：5'-TGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3'，反向引物：5'-CGCTGTGTGTTTTGTTCTTTACCC-3'。VEGF 正向引物：5'-CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG-3'，反向引物：5'-GCAAGTACGTTCGTTTAACTC-3'。GAPDH正向引物：5'-GAGAGGAGAAGAAGCTTTACAC-3'，反向引物：5'-CCAAGCAATTCCAATGAA-3'。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15分鐘，85 ℃ 5秒，逆轉(zhuǎn)錄得到模板cDNA。熒光定量PCR檢測HIF-1α、VEGF mRNA基因的表達。PCR反應體系總體積20 μl，包括PCR正向、反向引物各0.8 μl，SYBR Premix Ex Taq 10 μl，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μl，ddH2O 6 μl，DNA 模板 2 μl。設置好反應條件后，計算機系統(tǒng)自動控制反應并實時檢測，繪制擴增曲線并分析。運用△Ct 法來評價實驗結果，具體方法如下：①根據(jù)每個樣本的各個基因的Ct值來計算其△Ct 值：△Ct = Ct 目的基因-Ct GAPDH；②根據(jù)步驟①計算所得△Ct 值計算相對于對照組的△△Ct值：△△Ct =△Ct 實驗組-△Ct 對照組；③計算2-△△Ct 的數(shù)值，即為實驗組樣本的目的基因相對于對照組樣本的目的基因變化的倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003 version軟件進行。計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用SNK法、單因素方差分析法(ANOVA)進行相關比較，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OCCM-30細胞缺氧后增殖情況(圖1) MTT分析法結果顯示，其OD 570 nm值和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，提示缺氧可以抑制OCCM-30細胞的增殖，并且隨著缺氧時間的延長，缺氧抑制OCCM-30細胞增殖的作用越明顯。

2.2 OCCM-30細胞后凋亡情況(圖2) 流式細胞術檢測表明，缺氧可明顯提高OCCM-30細胞的凋亡率，而且隨缺氧時間的延長，OCCM-30細胞凋亡率逐漸增加。正常培養(yǎng)的各對照組中細胞的凋亡率均為(1.52±0.12)%。

2.3 OCCM-30細胞中HIF-1α mRNA的表達變化 隨著缺氧的進行，HIF-1α mRNA的表達逐步上調(diào)，在24小時達到頂峰，進入平臺期，從24小時起至72小時，HIF-1α mRNA的表達水平無明顯差異(P> 0.05)，見圖3。

圖1 OCCM-30細胞缺氧后增殖情況 與空白對照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

圖2 OCCM-30細胞缺氧后凋亡情況 與對照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

圖3 OCCM-30細胞缺氧后HIF-1α mRNA的表達變化 與對照組比較：*P < 0.05，**P < 0.01

2.4 OCCM-30細胞中VEGF mRNA的表達變化

細胞缺氧后6 h組、12 h組、24 h組VEGF mRNA的表達水平?jīng)]有顯著變化(P> 0.05)，從36 h組開始，表達水平逐步上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)，見圖4。

3 討論

Steinbrech等[3]研究表明，缺氧能顯著抑制體外培養(yǎng)的成骨細胞的增殖活性。本實驗結果顯示，缺氧明顯抑制OCCM-30細胞的增殖，并且具有明顯的時間依賴性，隨著缺氧時間的延長，這種抑制作用越明顯，與大多數(shù)研究結果一致。但有研究學者也認為，缺氧既有促進細胞增殖的作用，也有抑制效應，Piret等[4]則認為缺氧的具體效應與細胞的種類、缺氧程度密切相關。缺氧微環(huán)境對細胞增殖的調(diào)控是通過細胞分裂周期、細胞代謝相關蛋白的調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的，但具體機制仍待進一步研究。

圖4 OCCM-30細胞缺氧后VEGF mRNA的表達變化

本實驗中對照組細胞的凋亡率為1.52%，與文獻報道的體外培養(yǎng)細胞的正常凋亡率基本一致，反應細胞正常的更替。細胞缺氧后6 h，凋亡率高于對照組，但無明顯差別，在12 h后，細胞凋亡率逐步上升，且差異均具有統(tǒng)計學意義，說明缺氧能顯著提高OCCM-30細胞的凋亡率。在正畸矯治過程中，成牙骨質(zhì)細胞受到了機械矯治力和缺氧微環(huán)境的共同作用，細胞凋亡程序啟動，加速了細胞凋亡，影響到牙骨質(zhì)受損后的修復。

Akeno等的研究表明[5]，HIF-1α在細胞缺氧特異性應答的過程中發(fā)揮了調(diào)控作用，被認為是缺氧環(huán)境與細胞功能變化間的橋梁，是細胞缺氧后一系列變化的啟動因子，接受HIF-1α調(diào)控的下游基因在其增強子或者啟動子結構中具備一個或多個能與HIF-1α連接位點[6]。本實驗研究顯示，缺氧能顯著誘導HIF-1α mRNA的表達，在缺氧6小時后，HIF-1α mRNA的表達量相比對照組即有明顯的提高，并隨著缺氧時間的延長表達逐步上調(diào)，在24小時達到頂峰，進入平臺期，從24小時起至72小時，HIF-1α的表達水平無明顯差異?？梢钥闯觯诟惺艿饺毖跷h(huán)境后，作為細胞感受氧分壓下降后的上游基因，HIF-1α在很短時間內(nèi)調(diào)控即發(fā)生了變化。24小時后表達達到了高峰，可能是由于細胞內(nèi)HIF-1α mRNA表達量的持續(xù)增加、累積，抑制了其繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，同時，細胞凋亡率上升，細胞活力開始下降，導致正常的轉(zhuǎn)錄水平下降。

在骨折/骨損傷修復中，成骨細胞分泌表達的VEGF誘導了新血管的生長，為新骨的形成及重塑提供必要的營養(yǎng)支持[7]。同時，VEGF還能通過影響骨細胞的分化進程、增殖效率來促進骨生成和重塑，在骨折重建過程中發(fā)揮重要作用[8]。本實驗結果顯示，缺氧微環(huán)境能顯著誘導OCCM-30細胞VEGF mRNA的表達上調(diào)，但與成骨方面的研究相比在表達的時效性上存在差別，在缺氧后36小時表達量才逐步上升，可能是因為OCCM-30細胞具備成牙骨質(zhì)細胞的特性，成牙骨質(zhì)細胞與成骨細胞相比屬于惰性細胞，大多數(shù)情況下處于未激活狀態(tài)，因而在對缺氧應答上存在差異。本實驗尚未觀察到VEGF mRNA表達在上調(diào)后繼而下降的現(xiàn)象，可能是因為實驗設定觀察時間較短，需要進一步研究。綜上所述，缺氧能顯著抑制成牙骨質(zhì)細胞的活性，在正畸導致的牙骨質(zhì)吸收過程中發(fā)揮著重要的作用。

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Effect of hypoxia on proliferation，apoptosis and hypoxia-related gene of cementoblast-like cells

WUHaoa，HANHong-juana，RENXia-huaa，LIANGLinb

(a.DepartmentofStomatology，b.DepartmentofPharmacy，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

Objective To investigate the influence of hypoxia on proliferation，apoptosis and hypoxia-related gene of cementoblast-like cells in order to understand the role of hypoxia in orthodontic-induced cementum absorption.Methods A cell hypoxic model was constructed by using a special incubator.At the same time，cell cultured under normal oxygenic pressure was used as control.MTT，F(xiàn)CM and RT-PCR were used to measure the proliferation ratio，apoptosis ratio and mRNA expressions of HIF-1α and VEGF.Results Hypoxia could depress the cell proliferation，increase apoptosis ratio and induce mRNA expressions of HIF-1α and VEGF of OCCM-30 cells.The expressions of HIF-1α mRNA reached the highest platform at 24 h after hypoxia while the expression of VEGF mRNA started to increase after 36 h of hypoxia.Conclusion Hypoxia could inhibit the cell proliferation and increase the cell apoptosis and hypoxia-relative gene expressions.

Hypoxia；Cementoblast-like cell；OCCM-30；Proliferation；HIF-1α

R780.2

A

1672-6170(2015)01-0043-03

2014-08-20；

2014-10-10)