袁 燕，王紅斌，BARROW Colin J,楊文榮

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500; 2.云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500; 3.澳大利亞迪肯大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院化學(xué)與生物技術(shù)中心，澳大利亞 吉朗 VIC3216)

SDS-PAGE電泳法測(cè)定蒜頭果蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量

袁 燕1,2，王紅斌1,2，BARROW Colin J3,楊文榮3

(1.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500; 2.云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650500; 3.澳大利亞迪肯大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院化學(xué)與生物技術(shù)中心，澳大利亞 吉朗 VIC3216)

蒜頭果蛋白(malanin)是從廣西、云南特有植物蒜頭果中分離、純化出的一種新的、具有抗腫瘤活性的植物蛋白質(zhì).采用變性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)定malanin的相對(duì)分子質(zhì)量.結(jié)果表明，malanin是一種雙鏈蛋白質(zhì)，由A、B 2條肽鏈通過二硫鍵連接而成，其相對(duì)分子質(zhì)量約為65.94×103.方法具有簡(jiǎn)單、快速、直觀的特點(diǎn).

蒜頭果蛋白；SDS-PAGE；相對(duì)分子質(zhì)量

蒜頭果(malaniaoleiferachun et S.Lee)屬于鐵青樹科(Olacaceae)蒜頭果屬[1]，是中國(guó)特有單種屬稀有植物，國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹種[2]，廣西重點(diǎn)保護(hù)野生植物，僅分布于云南東南部和廣西西部的狹窄地帶[3].

蒜頭果蛋白(malanin)是通過粉碎、抽提、硫酸銨沉淀、疏水色譜層析等方法從廣西、云南特有植物蒜頭果(malaniaoleifera)中分離純化出一種新的、具有抗腫瘤活性的糖蛋白[4].體外抗腫瘤活性表明malanin具有明顯抑制人宮頸癌(HeLa)、人白血病(K562) 、人乳腺癌(MCF-7)和神經(jīng)瘤(PC-12)等腫瘤細(xì)胞體外增殖的能力，其半致死濃度IC50值分別為1.54× 10-10、1.58×10-8、1.12×10-8和7.71×10-9mol·L-1[4]，說明malanin具有非常強(qiáng)的抗腫瘤活性，可作為抗癌藥物的先導(dǎo)分子，具有用于免疫毒素治療癌癥的應(yīng)用前景.

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，由于其機(jī)械強(qiáng)度好，透明有彈性，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，沒有吸附作用和電滲作用，可通過改變丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度而制成不同孔徑的凝膠等優(yōu)點(diǎn)，故被廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離[5-6].

1967年Shapiro等發(fā)現(xiàn)，在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)后，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于其相對(duì)分子質(zhì)量，而與它的形狀及所帶電荷無關(guān).因此，要測(cè)定某一蛋白質(zhì)分子的相對(duì)分子質(zhì)量，只需比較該蛋白質(zhì)與其他已知相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠電泳上的遷移率即可[7-8].本文通過變性SDS-PAGE凝膠電泳，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，遷移率為橫坐標(biāo)作回歸方程，計(jì)算malanin的相對(duì)分子量，為malanin的基本理化性質(zhì)提供參考數(shù)據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

丙烯酰胺/亞甲基雙丙烯酰胺(Pharmacia公司)；十二烷基硫基鈉(SDS)、考馬斯亮藍(lán)G-250(Biom公司)；β-疏基乙醇、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)(Amresco公司)；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(Protein Molecular Weight Markers)(Promega公司)；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 儀器

蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)(Hoefer SE260)(Amersham公司)；Milli-Q純水機(jī)(MILLIRORE公司)；萬分之一天平(Sartorius,BP110S).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Malanin樣品的處理

取少量溶液或凍干的樣品分別置于1.5 mL eppendorf 管中，加入等體積比的1×樣品緩沖液.震蕩后置于沸水浴中煮沸5 min.冷卻，離心機(jī)離心10 s，冷卻后備用.

1.3.2 不連續(xù)SDS-PAGE電泳

按Laemmli[9]方法進(jìn)行，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為3%[10].

1) 鑄分離膠.將玻璃板、梳子和隔條用蒸餾水沖洗凈，涼干后，裝好模具，用移液器將12%分離膠溶液加入模具中，液面距頂端1/3～1/4處，加滿去離子水，自然聚合30～60 min[11].

2) 鑄壓縮膠.待分離膠聚合后，將上層去離子水倒掉，用濾紙吸干去離子水后注入3%的濃縮膠，同時(shí)插入10孔樣品梳，待其自然聚合30 min左右[12].

3) 上樣.將制好的凝膠裝進(jìn)電泳槽，加入電泳緩沖液(1×)，取出梳子，每孔加15 μL樣品.

4) 電泳測(cè)定.接通電泳儀電源進(jìn)行電泳分析，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部時(shí)，關(guān)閉電源，停止電泳.

5) 染色與固定.電泳完畢后，將分離膠小心地從玻璃板上取下，放入裝有考馬斯亮藍(lán)G-250染色液的表面皿中，用搖床染色30 min左右[13].

6) 脫色.染色與固定后的凝膠浸于脫色液中脫色，30 min左右換一次脫色液，直至無蛋白質(zhì)處無色透明為止.

7) 保存.脫色后凝膠用數(shù)碼相機(jī)照相保存.

1.3.3 Malanin相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

分子量測(cè)定按Fairbanks[14]方法，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，遷移率為橫坐標(biāo)作直線回歸圖，以回歸方程計(jì)算出相對(duì)分子質(zhì)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 不連續(xù)SDS-PAGE電泳

圖1中第3孔可以看到只有一條帶，說明malanin純度比較高，用β-巰基乙醇處理后的malanin被裂解成2個(gè)條帶，分子量小的下面那條帶命名為A鏈，分子量大的上面那條帶命名為B鏈(圖1的第4個(gè)孔道).此結(jié)果說明malanin是一種雙鏈蛋白質(zhì)，由A、B 2條肽鏈通過二硫鍵連接而成的.

2.2 Malanin相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

由于蛋白質(zhì)的遷移率與分子質(zhì)量成正比，因而可以用SDS-PAGE電泳來測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量.通過已知蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量常用對(duì)數(shù)與相對(duì)遷移率(Rf)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)的分子則可由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出.Rf=蛋白質(zhì)的遷移距離/示蹤染料距離.蛋白質(zhì)的遷移距離是指從分離膠的起始位到蛋白質(zhì)條帶的前沿[15].

按Fairbanks方法，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與相對(duì)遷移率(Rf)作直線回歸圖，由回歸方程即可算出malanin及其A、B鏈的相對(duì)分子質(zhì)量.圖2得出的直線方程為：y=-1.530 4x+2.282 3，根據(jù)malanin及A、B鏈的Rf值可以算出malanin及A、B鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為65.94×103、30.05×103和20.94×103.

3 結(jié)果與討論

采用不連續(xù)變性SDS-PAGE凝膠電泳法，以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，遷移率為橫坐標(biāo)作回歸方程，得到malanin的相對(duì)分子量65.94×103，由于加入β-巰基乙醇處理后，蒜頭果蛋白被裂解成二條鏈，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為30.05×103和20.94×103，說明malanin是由A、B 2條肽鏈通過二硫鍵連接而成，此結(jié)果為malanin的基本理化性質(zhì)提供較好的參考數(shù)據(jù).SDS-PAGE電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量具有簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是目前鑒定蛋白質(zhì)純度及測(cè)定分子質(zhì)量比較好的方法.但由于電泳方法測(cè)定的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量誤差較大，一般在5%～10%之間.近幾年出現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜能實(shí)現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量在幾萬以上大分子蛋白質(zhì)的精確測(cè)定，成為質(zhì)譜學(xué)家和生化學(xué)家的一個(gè)研究熱點(diǎn).本文采用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)測(cè)定malanin相對(duì)分子質(zhì)量為61.875×103，其誤差為6.63%，結(jié)果令人滿意.

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[15] 汪家政,范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

(責(zé)任編輯 王 琳)

Determination of the relative molecular mass of malanin with SDS-PAGE

YUAN Yan1,2,WANG Hong-bin1,2,BARROW Colin J3,YANG Wen-rong3

(1. Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China, Yunnan Minzu University,Kunming 650031,China; 2.Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan, Yunnan Minzu University,Kunming 650500,China; 3.Center for Chemistry and Biotechnology,School of Life and Environmental Sciences,Deakin University,Geelong,VIC 3216,Australia)

Malanin,a novel plant protein with anti-tumor activities,was isolated and purified from an endemic plant ofmalaniaoleiferain Guangxi and Yunnan provinces. The relative molecular mass of malanin was determined by the denaturing sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). The result has showed that malanin is a protein with two chains,chain-A and chain-B,which are cross-linked by one or two disulfide bonds,and its relative molecular mass is about 65 94×103. SDS-PAGE gel electrophoresis is a simple,fast,direct-viewing method to determine the relative molecular mass of malanin.

malanin; SDS-PAGE; relative molecular mass weight

2014-11-25.

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260500)；教育國(guó)際化平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(218-02001001002129)；云南省“無機(jī)化學(xué)精品課程”資助項(xiàng)目(2012HX08,2012HX12).

袁燕(1975-),女,博士,副教授,碩士生導(dǎo)師.主要研究方向:生物有機(jī)化學(xué).

Q516

A

1672-8513(2015)02-0123-03