高亞賢，王永為，郭亞春，宋鴻儒，肖麗君，安高，梁秀軍，翟澤玲，段一娜

(承德醫(yī)學院1.免疫學教研室；2.人體解剖學教研室；3.病原生物學教研室；4.預防醫(yī)學教研室，承德 067000)

·藥物研究·

穿山龍總皂苷對大鼠滑膜細胞株VEGF與AP-1的影響*

高亞賢1，王永為2，郭亞春3，宋鴻儒1，肖麗君1，安高1，梁秀軍1，翟澤玲1，段一娜4

(承德醫(yī)學院1.免疫學教研室；2.人體解剖學教研室；3.病原生物學教研室；4.預防醫(yī)學教研室，承德 067000)

目的 觀察含穿山龍總皂苷血清對大鼠滑膜細胞株RSC-364血管內皮細胞生長因子(VEGF)mRNA和激活蛋白-1(AP-1)活性的影響，探討其抑制血管新生的作用機制。方法 制備含穿山龍總皂苷和雷公藤(陽性對照)血清。將培養(yǎng)好的大鼠滑膜細胞株RSC-364分為空白對照組、模型對照組、含雷公藤多苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組，培養(yǎng)1 h，除空白對照組外，其余各組加入IL-17和TNF-α(均為10 μg·L-1)共同孵育24 h。采用實時熒光定量PCR方法檢測各組細胞VEGF mRNA表達，凝膠電泳遷移率實驗法(EMSA)檢測各組細胞核蛋白提取物AP-1 的DNA結合活性。結果 與空白對照組比較，模型對照組VEGF mRNA表達水平及AP-1 DNA結合活性顯著增高(P<0.05，P<0.01)；與模型對照組比較，含雷公藤多苷血清組、含穿山龍總皂苷血清組VEGF mRNA表達水平及AP-1 DNA結合活性均降低(P<0.05)，且兩組間比較，差異無統計學意義。結論 含穿山龍總皂苷血清可以抑制VEGF mRNA表達水平及AP-1 DNA結合活性，其機制可能是通過抑制轉錄因子AP-1來調控血管新生關鍵因子VEGF產生，進而抑制血管新生。

穿山龍總皂苷；關節(jié)炎，類風濕；血管新生；RSC-364；血管內皮生長因子；激活蛋白-1

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種病因尚未明了的慢性自身免疫性功能障礙性疾病。近年來研究發(fā)現，血管新生和血管翳的形成，在RA的發(fā)生發(fā)展過程中起至關重要的作用。血管新生是產生和維持RA血管翳的必需條件，因此，抑制血管新生可能是治療RA的一個新靶點。筆者前期研究已經證實，穿山龍總皂苷抑制血管新生與抑制滑膜血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)表達有關[1]。另有研究發(fā)現，通過抑制激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)可以影響VEGF的表達[2]。在前期研究基礎上，筆者以白細胞介素17 (interleukin-17,IL-17)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)聯合誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞模型為研究對象，通過觀察穿山龍總皂苷對VEGF mRNA及AP-1活性的影響，從基因水平及其信號轉導途徑進一步了解穿山龍總皂苷抑制血管新生的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級Wistar大鼠30只，雄性，體質量(260±20) g，購自北京維通利華實驗技術有限公司，動物合格證號：0248274，動物許可證號：SCXK(京)2009-0004。實驗前適應性喂養(yǎng)1周，攝食標準顆粒飼料，自由飲水。動物房自然光線，溫度、相對濕度分別維持在約20 ℃、70%。

1.2 細胞 大鼠滑膜細胞株RSC-364由河北醫(yī)科大學惠贈。

1.3 藥物與試劑 穿山龍總皂苷[承德醫(yī)學院中藥研究所提取，含量：6.5%。通過大量預實驗，選擇對實驗結果影響較大的因素：乙醇濃度、加熱溫度、不同提取時間，以提取物中薯蕷皂苷元含量和轉移率為指標，采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)法測定薯蕷皂苷元含量；采用正交實驗優(yōu)選穿山龍總皂苷最佳提取工藝，優(yōu)選后的穿山龍總皂苷最佳提取工藝為穿山龍飲片分別加入10倍和8倍量50%乙醇，85 ℃加熱回流1 h，過濾，收集濾液，合并兩次濾液，回收乙醇，噴霧干燥]；雷公藤多苷片(黃石飛云制藥有限公司，規(guī)格：每片10 mg，批號：Z42021212)；Trizol Reagent 購自Invitrogen公司，批號：15596-026；RT master Mix以及Taq DNA polymerase購自大連寶生物公司，批號分別為DRR036s，DRR039s；Nuclear Extract Kit購自美國Active Motif公司，批號：40010；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白含量測定試劑盒，購自美國Pierce公司，批號：23227；DIG Gel Shift Kit地高辛凝膠電泳遷移率實驗(EMSA)試劑盒購自德國Roche公司，批號：03353591510；AP-1探針由上?；迳锟萍加邢薰驹O計。

1.4 儀器 SLAN熒光定量PCR檢測系統(Real-time PCR Detection System)：上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.5 含藥血清的制備與大鼠分組和給藥方法 將穿山龍總皂苷和雷公藤多苷片分別溶于純化水中，制成懸濁液。取Wistar大鼠30只，采用隨機分組方法，根據隨機分組表分組選取15只大鼠給予穿山龍總皂苷100 mg·kg-1·d-1，灌胃，另外15只大鼠給予雷公藤多苷片120 mg·kg-1·d-1，灌胃。均連續(xù)灌胃7 d，第8天給藥1 h后，下腔靜脈無菌取血，離心取血清，過濾除菌備用。

1.6 實時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA表達水平

1.6.1 細胞分組及處理 選用處于對數生長期的RSC-364細胞，消化后制成2×104個·mL-1細胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL。將細胞分為空白對照組、模型對照組、含雷公藤皂苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組，每組設復孔6個，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長滿6孔板80%后，將孔內培養(yǎng)液吸出棄去，空白對照組和模型對照組分別加入培養(yǎng)液和20%正常大鼠血清，含雷公藤皂苷血清組和含穿山龍總皂苷血清組分別加入培養(yǎng)液及20%含雷公藤皂苷血清(在加入細胞的培養(yǎng)液總體積中，大鼠含藥血清體積占20%，其他正?；炯毎囵B(yǎng)液如胎牛血清等占80%)和20%含穿山龍總皂苷血清，均培養(yǎng)1 h，除空白對照組外，其余各組加入TNF-α(10 μg·L-1)+IL-17(10 μg·L-1)，共同孵育24 h。

1.6.2 總RNA提取及cDNA合成 取“1.6.1”項培養(yǎng)的細胞，棄去上清液，Trizol法提取細胞總RNA，檢測RNA純度和濃度，取純度較好的樣品(260 nm/280 nm比值均在2.0～2.2)進行逆轉錄反應，反應體系10 μL，反應條件為37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，cDNA置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.3 PCR擴增VEGF VEGF及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldelyde-3-phosphate dehydrogonse,GAPDH)的引物、探針由大連寶生物公司合成(序列見表1)。反應體系25 μL，反應條件：95 ℃預變性60 s 、95 ℃、10 s，60 ℃、30 s擴增循環(huán)40個，60 ℃讀取熒光。每個樣品設平行復孔3個取平均值。依據所得目的基因與內參基因Ct值(Ct值即每個反應孔內熒光信號達到設定閾值時所對應的循環(huán)數)，用內參進行標準化處理，按照2-ΔΔCt法[3]對基因表達進行相對定量分析，ΔΔCt=(待測組目的基因Ct均值-待測組內參照基因Ct均值)-(對照組目的基因Ct均值-對照組內參照基因Ct均值)。2-ΔΔCt代表目的基因在不同組織的相對表達量，進行實驗數據分析。

1.7 凝膠電泳遷移率實驗法(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測AP-1 DNA結合活性

1.7.1 細胞分組及處理 同“1.6.1”項。

1.7.2 滑膜細胞核蛋白的提取 參照Nuclear Extract Kit說明書的操作步驟，提取滑膜細胞核蛋白，采用BCA分析法測定樣本核蛋白濃度，將核蛋白分裝置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 VEGF與GAPDH引物與探針序列

1.7.3 EMSA檢測滑膜細胞核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性 將適量核蛋白抽提物與地高辛標記的AP-1寡核苷酸探針結合，AP-1探針序列如下，P1：5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′；P2：5′-TTCCGGCTGAGTCATCAAGCG-3′。實驗中設置陰性對照組，只加入探針藥物作為參照。反應產物經6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉膜，加化學發(fā)光底物(chemiluminescence substrate,CSPD)，X線膠片曝光，然后顯影、定影，凝膠分析系統進行灰度掃描，以灰度值對轉錄因子和標記探針結合活性進行半定量分析。

2 結果

2.1 各組滑膜細胞VEGF mRNA的表達 SLAN熒光定量PCR檢測系統擴增儀完成PCR反應后，自動生成熒光強度曲線，見圖1。模型對照組VEGF目的基因表達量(3.67±0.51)，明顯高于空白對照組[(1.0±0.28)，P<0.05]。含雷公藤皂苷血清組、含穿山龍總皂苷血清組VEGF目的基因表達量分別為(1.54±0.24)，(1.23±0.43)，與模型對照組比較，均明顯降低(P<0.05)，兩組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 各組滑膜細胞核蛋白提取物AP-1的DNA結合活性 與空白對照組(112.5±8.2)比較，模型對照組滑膜細胞核蛋白提取物AP-1 DNA結合活性(221.0±12.7)顯著增高 (P<0.01)；與模型對照組比較，含雷公藤血清組和含穿山龍總皂苷血清組AP-1 DNA結合活性[分別為(116.5±8.2)和(118.0±10.9)]降低(P<0.05)，兩組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

control：空白對照組；IL-17+TNF-α：模型對照組；TP：含雷公藤皂苷血清組；RDN：含穿山龍總皂苷血清組

圖1 VEGF和GAPDH擴增曲線

control：blank control group；IL-17+TNF-α：model control group；TP：tripterygium medicated serum group；RDN：total saponins medicated serum group

Fig.1 Amplification curve of VEGF and GAPDH

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，其主要病理特征為關節(jié)滑膜增生、血管翳形成及對稱性、破壞性關節(jié)病變，其發(fā)病機制尚不清楚。血管新生是產生和維持RA血管翳的必要條件，在促進RA發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[4-5]。

RA滑膜組織表達許多促血管生成因子，它們在RA血管生成的過程中發(fā)揮了重要作用，其中對VEGF的研究較為深入。VEGF是一種特異作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子，屬于血小板源生長因子家族成員，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受體調控著內皮細胞增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)，在血管新生中起著非常關鍵的作用[6]。正常情況下，血管內皮細胞更新緩慢，VEGF低表達，在RA患者的活組織檢查中發(fā)現，滑膜細胞中VEGF的釋放顯著升高[7]。臨床研究表明，RA患者的外周血VEGF越高，其受累的關節(jié)數目越多，關節(jié)病變越嚴重，并認為外周血的VEGF值可以作為像血沉一樣反映RA患者病情嚴重程度的一項評價指標[8]。雷公藤是目前治療RA藥物中療效已被肯定的中藥[9]，雷公藤多苷是其主要成分。近年來，一系列文獻報道雷公藤能夠下調膠原誘導性關節(jié)炎(collagen induced arthritis,CIA)大鼠滑膜組織VEGF的表達，抑制血管新生[10]。以往的研究均采用常規(guī)RT-PCR的方法，定量不準確，變異性較大。本研究采用實時熒光定量PCR方法對各細胞組VEGF mRNA的表達進行定量分析，結果顯示IL-17+TNF-α誘導的細胞模型對照組VEGF目的基因表達量升高，含穿山龍總皂苷血清組VEGF目的基因表達量顯著降低，其效果與含雷公藤血清組比較差異無統計學意義，提示穿山龍總皂苷可能通過抑制VEGF的表達進而減少血管新生，與文獻[10]報道一致。

1.陰性對照組；2.空白對照組；3.模型對照組；4.含雷公藤皂 與空白對照組比較，*1P<0.01;與模型對照組比較，*2P<

苷血清組；5.含穿山龍總皂苷血清組 0.05

圖2 4組AP-1的DNA結合活性比較(EMSA)

1.negative control group；2.blank control group;3.model control Compared with blank control group，*1P<0.01; compared

group;4.tripterygium medicated serum group;5.total saponins from with model group，*2P<0.05

RhizmaDioscreneNipponicaemedicated serum group

Fig.2 Comparison of DNA-bonding activity of AP-1 among four groups (EMSA)

AP-1是一類由早期反應基因編碼而成的對氧化還原敏感的核轉錄因子，是由癌基因Fos和Jun家族的相關轉錄因子組合成的二聚體，其中c-fos和c-jun形成的異源二聚體是AP-1的主要形式，AP-1能直接或間接地識別或結合在同一順式作用元件8-12bp核心序列上，參與許多生長因子和細胞因子的基因轉錄調控，導致機體一系列生理病理變化[11]。ASAHARA等[12-13]研究發(fā)現，RA 和CIA小鼠滑膜組織中 AP-1 活性明顯高于骨關節(jié)炎，并主要定位于滑膜襯里層成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLSs)中。BOYLE等[14]從 CIA 小鼠滑膜組織中也觀察到 AP-1 活性增高早于關節(jié)炎癥狀的出現以及基質金屬蛋白酶的表達。在VEGF的基因中含有Jun/Fos二聚體即轉錄因子AP-1結合位點，佛波酯可以誘導早期應答基因c-jun/c-fos的表達來促進此位點的形成，進而與VEGF的基因結合來增強VEGF表達。有研究顯示，雷公藤內酯醇能抑制佛波酯誘導的內皮細胞中VEGF的合成和分泌，也可以抑制原癌基因c-jun/c-fos mRNA在內皮細胞中的表達，提示TP可能通過抑制AP-1的形成，來影響VEGF的表達[2]。另有研究也表明，雷公藤可能通過抑制AP-1蛋白復合體的結合，抑制VEGF的合成[15]。在本實驗中應用凝膠電泳遷移率實驗檢測各組細胞核蛋白提取物中AP-1的DNA結合活性，結果發(fā)現IL-17和TNF-α聯合刺激可使AP-1的DNA結合活性顯著增強，加入含穿山龍總皂苷血清可使IL-17和TNF-α聯合刺激RSC-364細胞的AP-1的DNA結合活性減弱，且與含雷公藤血清組比較差異無統計學意義，表明穿山龍總皂苷可能抑制AP-1的活性，同時，前面實驗已進一步證實穿山龍總皂苷可以顯著降低VEGF mRNA水平，推測如文獻報道[15]，穿山龍總皂苷可能通過抑制AP-1來下調VEGF的表達，進而抑制血管新生。

綜上所述，本研究應用IL-17和TNF-α聯合誘導的大鼠滑膜細胞株RSC-364細胞模型，證實了穿山龍總皂苷含藥血清可以抑制VEGF mRNA的表達水平及AP-1的DNA結合活性，考慮穿山龍總皂苷可能通過抑制轉錄因子AP-1來調控血管新生關鍵因子VEGF的產生，進一步抑制RA血管新生。然而，細胞內存在的信號轉導通路形成精密的調控網絡，不同途徑之間存在多種交互的聯系，這給信號轉導的研究帶來了困難，關于穿山龍總皂苷抑制VEGF調控機制如何，仍有待進一步深入研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.001

Effects of Total Saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicaeon VEGF and AP-1 in Rat Synovial Cell Strain

GAO Yaxian1，WANG Yongwei2，GUO Yachun3，SONG Hongru1，XIAO Lijun1，AN Gao1，LIANG Xiujun1，ZHAI Zeling1，DUAN Yina4

(1.DepartmentofImmunology；2.DepartmentofHumanAnatomy；3.DepartmentofPathogenBiology；4.DepartmentofPhylaxiology,ChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China)

Objective To study the effects of medicated serum with total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN) on VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α.To investigate the mechanism about total saponin from RDN inhibition of angiogenesis. Methods Medicated serum of total saponins from RDN and tripterygium (positive control) were prepared.Rat synovial cells RSC-364 were divided into four groups: the blank control，IL-17+TNF-α model，tripterygium medicated serum，and total saponins medicated serum groups.After one hour of incubation，all groups except for the blank control were incubated with both IL-17(10 μg·L-1) and TNF-α(10 μg·L-1) for 24 hours.VEGF mRNA expression in RSC-364 was detected by PrimeScriptTMreal-time quantitative PCR (RT-PCR) detection kit，and the AP-1 DNA-binding activity was detected by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Results Compared with the control blank group，both of the VEGF mRNA expression and AP-1 activity in rat synovial cell strain RSC-364 induced by IL-17 and TNF-α increased remarkably (P<0.05，P<0.01).The VEGF mRNA expression and AP-1 activity in tripterygium medicated serum group and total saponins medicated serum group were remarkably lower than those of the model control group (P<0.05).There was no significant difference between the two medicated serum groups. Conclusion Serum medicated with total saponins from RDN can remarkably decrease VEGF mRNA expression and AP-1 activity，indicating that the total saponins from RDN could influence VEGF secretion by inhibiting the AP-1 signal transduction pathway，VEGF is the key factor of angiogenesis，thereby to restrain angiogenesis.

Total saponins fromRhizomaDioscreaeNipponicae(RDN)；Arthritis,rheumatoid；Angiogenesis；RSC-364；Vascular endothelial growth factors；activator protein-1

2014-01-18

2014-02-21

*國家自然科學基金資助項目(30873420)；河北省自然科學基金重點項目(C2007000916)；河北省高等學?？茖W技術研究項目(ZH200806)

高亞賢(1984-)，女，河北廊坊人，講師，碩士，研究方向：中藥免疫學。電話：0314-2517004，E-mail：yaxiangao@163.com。

宋鴻儒(1961-)，男，河北承德人，教授，碩士生導師，研究方向：中藥免疫學。電話：0314-2291166，E-mail：songhongru@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)03-0285-05