駱中華，呂飛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院消化科，武漢 430035)

小檗堿對(duì)大鼠肝硬化肝組織IFN-γ表達(dá)與端粒酶活性的影響

駱中華，呂飛

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院消化科，武漢 430035)

目的 探討小檗堿抑制血吸蟲(chóng)肝硬化組織惡性變潛能的作用及其機(jī)制。方法 將80只大鼠感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴，隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組20只。模型對(duì)照組(A組)不作任何治療；吡喹酮組(B組)感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d；小檗堿組(C組)感染尾蚴6周后給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周；小檗堿+吡喹酮組(D組)在感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再以小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周。另取10只大鼠作為正常對(duì)照組(E組)。第12周末分別留取各組大鼠肝組織，檢測(cè)肝臟Ⅰ、Ⅲ型膠原及干擾素-γ(IFN-γ)含量、端粒酶活性與端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(TERT)表達(dá)情況。結(jié)果 與A組比較，B組和C組肝纖維化程度均減輕，肝組織IFN-γ含量顯著升高，端粒酶活性與TERT表達(dá)水平降低(P<0.05)。與B組比較，C組大鼠肝纖維化程度、IFN-γ含量及端粒酶活性、TERT表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠肝纖維化程度進(jìn)一步減輕，肝組織IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)，端粒酶活性及TERT表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 小檗堿可通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠肝組織內(nèi)免疫應(yīng)答，促進(jìn)IFN-γ表達(dá)，抑制肝組織TERT表達(dá)及端粒酶活性，可配合吡喹酮對(duì)大鼠晚期血吸蟲(chóng)肝硬化起協(xié)同、增效作用。

小檗堿；吡喹酮；干擾素-γ；肝硬化；血吸蟲(chóng)；端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶；端粒酶

日本血吸蟲(chóng)肝病與肝癌的關(guān)系日益受到關(guān)注。流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料均表明，血吸蟲(chóng)感染在肝組織惡變中起到了某種直接或間接作用，抑制血吸蟲(chóng)肝纖維化組織惡性變潛能成為防治血吸蟲(chóng)病不可忽視的重要內(nèi)容之一[1]。小檗堿是黃連的提取物，目前研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿中具有抗肝纖維化、抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用[2-3]，但未見(jiàn)其作用于血吸蟲(chóng)肝病的研究報(bào)道。筆者在本實(shí)驗(yàn)中以日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染大鼠建立血吸蟲(chóng)肝纖維化模型，并給予小檗堿治療，觀察治療前后大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原和干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)含量、端粒酶(telomerase)活性以及端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)表達(dá)變化，探討小檗堿抑制血吸蟲(chóng)肝纖維化的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0009，動(dòng)物許可證號(hào)：HBDW NO：2008-1015。

1.2 藥物與試劑 鹽酸小檗堿片(東北制藥總廠生產(chǎn)，批號(hào)：130136，規(guī)格：每片0.1 g)，吡喹酮片(武漢康隆世紀(jì)醫(yī)藥制造有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：CP2010，含量：99.8%，規(guī)格：每片0.5 g)。上述藥物使用時(shí)以0.9%氯化鈉溶液配成懸濁液?？勾笫骉ERT抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司(批號(hào)：SC-68270)。端粒酶重復(fù)序列擴(kuò)增及酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(polymerase chain reaction-Telomeric repeat amplification-Enzymek-linked immunosorbent assay,PCR-TRAP-ELISA)試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(批號(hào)：11854666910)?？勾笫螈裥湍z原抗體(批號(hào)：BA0325)、抗大鼠Ⅲ型膠原抗體(批號(hào)：BA0326 )及鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex,SABC)試劑盒(批號(hào)：SA1052)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。 IFN-γ ELISA 試劑盒購(gòu)于美國(guó)PERPTOTECH 公司(批號(hào)：400-20)。

1.3 大鼠血吸蟲(chóng)病肝纖維化模型的建立及分組 將每只大鼠經(jīng)腹部皮膚人工感染血吸蟲(chóng)尾蚴25條，將感染后的大鼠80只隨機(jī)分為A、B、C、D組，每組20只。模型對(duì)照組(A組)感染尾蚴后不作任何治療；吡喹酮組(B組)感染尾蚴6周后予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，qd；小檗堿組(C組)感染尾蚴6周后給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周[4]，qd。小檗堿+吡喹酮組(D組)感染尾蚴6周后給予吡喹酮500 mg·kg-1·d-1灌胃2 d，再給予小檗堿150 mg·kg-1·d-1灌胃6周，qd。另取10只大鼠作為正常組(E組)。E組大鼠同時(shí)灌胃等體積0.9%氯化鈉溶液。感染血吸蟲(chóng)尾蚴后第12周末，A、B、C、D、E組分別存活10，12，13，15，10只，將各組大鼠處死后取相同部位肝組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組化檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原 采用SABC法，肝組織標(biāo)本染色后采用MPZAS-500多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)，計(jì)算平均積分吸光度值(A值)。

1.5 ELISA法檢測(cè)肝組織IFN-γ含量 取大鼠肝組織樣本(每份100 mg)，加入0.9%氯化鈉溶液在冰水中勻漿。以3 000×g離心5 min，取上清液，按照IFN-γ試劑盒說(shuō)明測(cè)定IFN-γ含量。

1.6 Western blot 檢測(cè)各組肝組織TERT 取大鼠肝組織樣本(每份100 mg)，勻漿、離心后吸取上清液，按照BCA 蛋白含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)分離后轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜(polyviny lidene fluoride,PVDF) 膜，以1：1 500兔抗大鼠TERT單克隆一抗4 ℃靜置孵育過(guò)夜，再以1：15 000過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2 h，暗室用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemilumine scence,ECL)試劑盒發(fā)光顯影，同時(shí)檢測(cè)β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照。圖片經(jīng)吸光度圖像掃描儀(HP) 掃描，以Quantity One 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，檢測(cè)各組大鼠肝組織TERT與β-actin表達(dá)灰度的比值。

1.7 PCR-TRAP-ELISA法檢測(cè)端粒酶活性 取大鼠肝組織(每份150 mg)，研碎，離心，取上清液進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。分別測(cè)定樣品與陽(yáng)性對(duì)照在波長(zhǎng)450及630 nm處A值。端粒酶相對(duì)活性=(樣本A450-A630/陽(yáng)性對(duì)照A450-A630)×150。

2 結(jié)果

2.1 肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量 E組大鼠肝組織無(wú)明顯膠原著色。A組、B組及C組肝內(nèi)Ⅰ、Ⅲ型膠原呈棕黃色，密集片狀，主要分布在蟲(chóng)卵肉芽腫內(nèi)及匯管區(qū)。與A組比較，B組、C組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量顯著下降(P<0.05)。D組肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量亦顯著下降(P<0.01)。與B組比較，C組大鼠肝組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量無(wú)明顯差異(P>0.05)，D組Ⅰ、Ⅲ型膠原含量較B組、C組顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1，2及表1。

2.2 肝組織IFN-γ含量 與A組比較，B組、C組大鼠肝組織IFN-γ含量均明顯升高(P<0.05)。D組肝組織IFN-γ含量亦明顯升高(P<0.01)。與B組比較，C組大鼠肝組織IFN-γ含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。與B組、C組比較，D組大鼠肝組織 IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)(表2)。

2.3 肝組織TERT表達(dá) 與A組比較，B組、C組肝組織TERT含量均顯著下降(P<0.05)；與B組比較，C組肝組織TERT含量無(wú)明顯下降(P>0.05)，而D組肝組織TERT含量較B組、C組均顯著下降(P<0.05)(圖3，表2)。

2.4 肝組織端粒酶活性 與A組比較，B組、C組肝組織端粒酶活性均顯著下降(P<0.05)；與B組比較，C組肝組織端粒酶活性無(wú)明顯下降(P>0.05)，而D組肝組織端粒酶活性較B組、C組均顯著下降(P<0.05)(表2)。

3 討論

大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，并發(fā)感染日本血吸蟲(chóng)病的慢性病毒性肝炎患者，肝癌發(fā)病率明顯增高，表明日本血吸蟲(chóng)感染可促進(jìn)肝癌發(fā)生[5]。目前研究表明，血吸蟲(chóng)及其形成的肝臟肉芽腫性炎癥、纖維化是肝癌發(fā)生的高危因素之一。蟲(chóng)卵肉芽腫導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)可降低細(xì)胞免疫功能，促使正常肝細(xì)胞中原癌基因p53等變異而成為癌基因和(或)致抑癌基因失活[6]，易導(dǎo)致細(xì)胞惡變。

圖1 5組大鼠肝組織Ⅰ型膠原表達(dá)情況(×200)

圖2 5組大鼠肝組織Ⅲ型膠原表達(dá)情況(×200)

與A比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與B組比較，*3P<0.05；與C組比較，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05；compared with group C，*4P<0.05

端粒酶異?；罨前┘?xì)胞無(wú)限增殖的關(guān)鍵，90%以上腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性顯著增加，而正常細(xì)胞或組織中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到端粒酶活性。因此端粒酶活性增高是區(qū)別正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的顯著特征，端粒酶活性可用作腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后的指標(biāo)之一[7]。TERT是端粒酶活性的主要催化亞單位，為端粒酶的必需和限速組成成分，僅存于端粒酶陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞中。

圖3 5組大鼠肝組織TERT表達(dá)(Western blot )

與A組比較，*1P<0.05，*2P<0.01；與B組比較，*3P<0.05；與C組比較，*4P<0.05

Compared with group A，*1P<0.05，*2P<0.01; compared with group B，*3P<0.05; compared with group C，*4P<0.05

研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌組織中TERT表達(dá)較癌旁組織明顯升高，而肝炎組織、肝硬化組織未見(jiàn)明顯TERT表達(dá)[8]。

IFN-γ作為Th1細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答功能的重要作用[9]。IFN-γ能激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等直接殺傷癌細(xì)胞。IFN-γ可通過(guò)抑制癌基因的表達(dá)來(lái)阻止或減慢腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而直接抑制腫瘤細(xì)胞生成與生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，可通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[10]。

A組大鼠肝纖維化組織端粒酶活性和TERT 表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示血吸蟲(chóng)肝纖維化組織具有產(chǎn)生惡性變的潛能。A組肝組織IFN-γ水平升高考慮可能為血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)和蟲(chóng)卵肉芽腫產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)而呈現(xiàn)的反應(yīng)性增高。吡喹酮治療后血吸蟲(chóng)肝纖維化組織端粒酶活性和TERT 表達(dá)明顯下降，表明吡喹酮可在一定程度上抑制血吸蟲(chóng)肝纖維化惡性變潛能發(fā)展，其機(jī)制可能為吡喹酮通過(guò)殺死血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、減少毒性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生而減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)IFN-γ表達(dá)而抑制血吸蟲(chóng)肝纖維化惡性變潛能進(jìn)一步發(fā)展。吡喹酮治療后血吸蟲(chóng)肝纖維化組織端粒酶活性和TERT表達(dá)仍明顯高于E組，提示殺蟲(chóng)治療后有必要盡早加用適宜藥物，以防血吸蟲(chóng)肝纖維化組織惡性變潛能進(jìn)一步發(fā)展。

應(yīng)用小檗堿治療時(shí)肝組織IFN-γ表達(dá)明顯增高，而TERT表達(dá)、端粒酶活性明顯下降，表明小檗堿可通過(guò)促進(jìn)IFN-γ表達(dá)降低端粒酶活而發(fā)揮抑制血吸蟲(chóng)肝纖維化惡性變潛能發(fā)展的作用。較之應(yīng)用吡喹酮，小檗堿治療端粒酶活性和TERT表達(dá)并無(wú)明顯下降。由此推測(cè)殺蟲(chóng)治療能減少血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵及蟲(chóng)卵肉芽腫的來(lái)源,在抑制血吸蟲(chóng)纖維化組織惡性變潛能發(fā)展的治療中可能仍發(fā)揮重要作用。值得注意的是，吡喹酮繼之以小檗堿治療可使血吸蟲(chóng)肝硬化組織中TERT表達(dá)和端粒酶活性較之吡喹酮或小檗堿治療明顯下降，推測(cè)兩者配合應(yīng)用在抑制血吸蟲(chóng)肝硬化惡性變潛能發(fā)展方面可起到協(xié)同、增效作用。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.006

Effects of Berberine on the Expression of IFN-γ and Activity of Telomerase in Rat Liver Cirrhosis Tissue

LUO Zhonghua,LY Fei

(DepartmentofGastroenterology,PuaiHospital,TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430035，China)

Objective To study the inhibitory effect and mechanism of berberine on the malignant potential of liver cirrhosis tissue due to schistosoma. Methods Eighty rats infected withschistosomajaponicumwere equally divided into A， B， C and D groups, twenty rats in each.Group A was taken as model control without any treatment.Group B was treated with praziquantel at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Group C was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks.Group D was treated with berberine at 150 mg·kg-1·d-1for 6 weeks followed by praziquantel treatment at 500 mg·kg-1·d-1for 2 days.Ten rats were taken as normal control group (group E).At 12th week， all rats were sacrificed and parts of liver tissues were preserved.The contents of IFN-γ，typeⅠ collagen， type Ⅲ collagen， telomerase reverse transcriptase (TERT )and the activity of telomerase in liver tissue before and after treatments were detected. Results Compared to the group A， the therapy of praziquantel or berberine singly reduced the contents of typeⅠand type Ⅲ collagens，TERT and the activity of telomerase and greatly raised the content of IFN-γ(P<0.05 ).Compared to the group B， there was no difference on the contents of IFN-γ，typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue between two groups(P>0.05).Compared to the group C or group B， the contents of typeⅠ collagen，type Ⅲ collagen，TERT and the activity of telomerase in liver tissue were obviously reduced and the content of IFN-γ was conspicuously elevated (P<0.05 ) in the group D. Conclusion Berberine can inhibit the malignancy by inhibiting the expression of TERT and the activity of telomerase via regulating immune response and promoting the expression of IFN- γ in liver tissue.Berberine may be used in symergism with the insecticidal treatment for advanced schistosomal hepatic cirrhosis.

Berberine；Praziquantel; Interferon-γ；Liver cirrhosis；Schistosomahepaticcirrhosis； Telomerase reverse transcriptase；Telomerase

2014-02-06

2014-03-10

駱中華(1969-)，男，湖北武漢人，副主任醫(yī)師，學(xué)士，研究方向：肝臟疾病防治。E-mail：tomz120@163.com。

R282.7；R965

A

1004-0781(2015)03-0306-04