王銀，黃小妹，陳文莉

(武漢市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430014)

羅格列酮對(duì)腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

王銀，黃小妹，陳文莉

(武漢市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430014)

目的 探討羅格列酮對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程的影響。方法 體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，并給予不同濃度TGF-β及羅格列酮處理，觀察HK-2形態(tài)學(xué)變化，利用免疫印跡檢測(cè)過(guò)氧化物酶體增殖激活物受體γ(PPARγ)、SMAD家族成員2/3、鈣粘附蛋白-E(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)水平變化，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)術(shù)檢測(cè)PPARγ、E-cadherin、Vimentin、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug的mRNA水平變化，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TGF-β及羅格列酮對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果 TGF-β可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生偽足增多變長(zhǎng)、細(xì)胞間隙變大等EMT樣形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)而激活TGF-β下游的SMAD2/3信號(hào)通路，導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)明顯減少，伴有間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志的Vimentin表達(dá)增高，轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug的mRNA水平分別升高6倍以上，伴隨E-cadherin啟動(dòng)子活性下降70%。羅格列酮可以顯著抑制上述TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程，表現(xiàn)為HK-2細(xì)胞足減少變短，細(xì)胞間隙變小等，同時(shí)伴有E-cadherin表達(dá)增加，Vimentin表達(dá)降低，Snail及Slug的mRNA水平明顯降低，E-cadherin啟動(dòng)子活性恢復(fù)到對(duì)照組水平。結(jié)論 羅格列酮可通過(guò)激活PPARγ促進(jìn)E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)，拮抗TGF-β誘導(dǎo)的EMT過(guò)程。

羅格列酮；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化；腎纖維化

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種細(xì)胞失去其上皮表型而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過(guò)程，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)作為誘導(dǎo)腎上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的重要細(xì)胞因子，與腎纖維化關(guān)系十分密切[2]。羅格列酮是過(guò)氧化物酶體增殖激活物受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)特異性外源性配體，通過(guò)激活PPARγ進(jìn)而抑制TGF-β信號(hào)通路，從而延緩以腎臟纖維化為代表的一系列腎慢性疾病進(jìn)程，對(duì)腎功能起保護(hù)作用[3]。但羅格列酮抑制TGF-β信號(hào)通路從而保護(hù)腎功能的機(jī)制尚不清。筆者利用體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞HK-2作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，給予一定劑量羅格列酮及TGF-β刺激，觀察羅格列酮是否可以逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程，以期為臨床治療腎臟纖維化提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2由武漢市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)，以含10%小牛血清和100 U·mL-1青霉素及100 μg·mL-1鏈霉素的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)液(Dulbecco's minimum essential medium，DMEM)置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 羅格列酮片(葛蘭素史克有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20020475，規(guī)格：4 mg，批號(hào)：122320-73-4，將4 mg羅格列酮溶于2 mL DMSO，加無(wú)水乙醇至5 mL，輔料可基本溶解完全，-20 ℃儲(chǔ)存待用)，TGF-β(Peprotech，批號(hào)：100-21)，抗PPARγ抗體(Santa Cruz，批號(hào)：sc-7196)，抗SMAD2/3抗體(Cell Signaling Technology，CST， 批號(hào)：5678)，抗p-SMAD2/3抗體(CST，批號(hào)：8828)，抗E-cadherin抗體(CST， 批號(hào)：3195)，抗Vimentin抗體(CST， 批號(hào)：5741)及抗內(nèi)參GAPDH抗體(CST，批號(hào)：No.5174)等均購(gòu)自武漢啟動(dòng)子生物有限公司。

1.3 PCR引物 自行設(shè)計(jì)，由武漢擎科生物公司合成。PPARγ (Forward Primer GGGATCAGCTCCGTGGATCT， Reverse Primer TGCACTTTGGTACTCTTGAAGTT)，E-cadherin(Forward Primer CGAGAGCTACACGTTCACGG， Reverse Primer GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG)， Vimentin (Forward Primer GACGCCATCAACACCGAGTT， Reverse Primer CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT)，Snail(Forward Primer TCGGAAGCCTAACTACAGCGA， Reverse Primer AGATGAGCATTGGCAGCGAG)，Slug(Forward Primer CGAACTGGACACACATACAGTG， Reverse Primer CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT)，GAPDH(Forward Primer GAGAGACCCTCACTGCTG， Reverse Primer GATGGTACATGACAAGGTGC)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 以終濃度為5 ng·mL-1TGF-β處理HK-2細(xì)胞48 h作為EMT誘導(dǎo)組，在此基礎(chǔ)上給予1.25 μmol·L-1羅格列酮作為治療組，以等量0.9%氯化鈉溶液處理的HK-2細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。檢測(cè)指標(biāo)：細(xì)胞形態(tài)學(xué)，TGF-β信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化，EMT相關(guān)基因mRNA水平變化，E-cadherin啟動(dòng)子活性變化。

1.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將HK-2細(xì)胞按照上述方法處理。分別處理細(xì)胞48 h后，普通光學(xué)顯微鏡下觀察HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，重點(diǎn)觀察細(xì)胞輪廓形態(tài)、偽足長(zhǎng)度及細(xì)胞間隙等。

1.6 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)TGF-β及羅格列酮處理后PPARγ、SMAD2/3、磷酸化SMAD2/3(p-SMAD2/3)、E-cadherin及Vimentin蛋白水平的變化 用0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，加入適量NP-40細(xì)胞裂解液冰上裂解離心后取上清液，加入適量SDS上樣緩沖液，混勻后100 ℃水浴5 min。繼而蛋白樣品行聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)轉(zhuǎn)膜并用脫脂奶粉封閉非特異性結(jié)合，然后依次孵育一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后用ECL顯色液顯影。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-q PCR)檢測(cè) TGF-β及羅格列酮處理后PPARγ、E-cadherin、Vimentin、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug的mRNA水平變化 收集細(xì)胞加入適量Trizol(Invitrogen)，三氯甲烷靜置分層，取水相抽提總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，No.K1633，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)操作說(shuō)明合成cDNA，之后按實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(Fermentas)應(yīng)用上述引物行PCR擴(kuò)增，ABI7300檢測(cè)并分析。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)TGF-β及羅格列酮處理后E-cadherin啟動(dòng)子活性的變化 將HK-2細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于24孔板，第2天當(dāng)細(xì)胞約70%融合時(shí)，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染包含有E-cadherin啟動(dòng)子的熒光素酶質(zhì)粒，加入不同濃度TGF-β及羅格列酮[藥物終濃度：TGF-β 0～10 ng·mL-1；羅格列酮0～1.25 μmol·L-1。兩藥物按照梯度加入]。置37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Promega)在多功能光度計(jì)上測(cè)定并分析。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對(duì)HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 普通光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，HK-2細(xì)胞經(jīng)過(guò)TGF-β(5 ng·mL-1)處理后，與陰性對(duì)照組比較，發(fā)生明顯的EMT變化，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，偽足增多變長(zhǎng)，細(xì)胞間隙變寬。而在給予TGF-β同時(shí)給予羅格列酮(1.25 μmol·L-1)，HK-2細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)上皮細(xì)胞形狀，細(xì)胞呈橢圓形，偽足減少變短，細(xì)胞間隙變窄。

2.2 羅格列酮對(duì)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將上述細(xì)胞裂解，提取總蛋白后行Western blot檢測(cè)。結(jié)果顯示，TGF-β可以激活SMAD信號(hào)通路，p-SMAD2及p-SMAD3含量明顯增加，上皮性標(biāo)志E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少，間質(zhì)性標(biāo)志Vimentin表達(dá)明顯增加；同時(shí)給予羅格列酮和TGF-β時(shí)，可激活PPARγ表達(dá)，抑制TGF-β所致p-SMAD2及p-SMAD3增加，E-cadherin表達(dá)較單加TGF-β處理明顯增加，Vimentin表達(dá)較單加TGF-β處理明顯減少(圖1)。

2.3 羅格列酮對(duì)EMT相關(guān)基因mRNA水平的影響 上述分組處理細(xì)胞后， Realtime-PCR法檢測(cè)PPARγ、E-cadherin、Vimentin、Snail及Slug的mRNA水平變化。結(jié)果提示，TGF-β可顯著降低E-cadherin的mRNA水平，升高Vimentin、Snail及Slug的mRNA水平，而羅格列酮可通過(guò)上調(diào)PPARγ逆轉(zhuǎn)TGF-β對(duì)E-cadherin的抑制作用，降低Vimentin、Snail及Slug等基因的mRNA水平(圖2)。

圖1 3組HK-2細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況

Fig.1 Results of granuloma test in eight groups of mice

圖2 羅格列酮可逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT相關(guān)基因mRNA水平

Fig.2 Reversion of rosiglitazone on the mRNA express of EMT related gene induced by TGF-β in HK-2 cells

2.4 羅格列酮對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子活性的影響 不同濃度TGF-β及羅格列酮處理HK-2細(xì)胞48 h后，檢測(cè)熒光素酶活性。隨著TGF-β濃度升高，TGF-β對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子活性的抑制作用顯著增加(P<0.05)，加入不同濃度羅格列酮可明顯逆轉(zhuǎn)這種抑制作用(P<0.05)(圖3)。

3 討論

EMT作為一種復(fù)雜而且重要的生物學(xué)效應(yīng)，廣泛參與多種病理生理進(jìn)程，如胚胎發(fā)育，器官形成，慢性纖維化性疾病的發(fā)生發(fā)展及惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[1，4]。由于慢性纖維化疾病發(fā)病隱匿，缺乏特效藥物，給患者健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，所以明確慢性纖維化疾病的病因，早期干預(yù)EMT進(jìn)程有可能延緩慢性纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展，故針對(duì)EMT開(kāi)發(fā)特異性藥物成為慢性纖維化疾病研究的當(dāng)務(wù)之急。

TGF-β是一種作用廣泛的細(xì)胞外因子，可以通過(guò)經(jīng)典的SMAD信號(hào)通路及其他非經(jīng)典途徑介導(dǎo)細(xì)胞增殖、凋亡及形態(tài)學(xué)變化等一系列生物學(xué)行為的調(diào)控[5]。研究表明，TGF-β可通過(guò)EMT促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[6]，因此調(diào)控TGF-β從而影響EMT可能是干預(yù)慢性纖維化進(jìn)程的有效手段。

圖3 羅格列酮可逆轉(zhuǎn)TGF-β對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子的影響

Fig.3 Reversion of rosiglitazone on the effect of TGF-β on E-cadherin promoter activity

噻唑烷二酮類藥物(troglitazone，TZDs)是一類體外合成的可以增加胰島素敏感性的化合物，其可以特異的高效結(jié)合并激活PPARγ，PPARγ繼而結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的PPARγ結(jié)合元件，從而參與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]。TZDs目前臨床上主要用于緩解2型糖尿病患者的胰島素抵抗及治療代謝綜合征。既往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠5/6腎切除腎衰竭及大鼠單側(cè)輸尿管梗阻等模型中，羅格列酮可以減輕大鼠腎間質(zhì)纖維化程度，對(duì)大鼠腎功能有一定保護(hù)作用[8-10]，但羅格列酮通過(guò)下調(diào)TGF-β保護(hù)腎臟功能的具體機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)中筆者通過(guò)體外培養(yǎng)腎間質(zhì)上皮細(xì)胞HK-2，發(fā)現(xiàn)羅格列酮在細(xì)胞形態(tài)學(xué)、蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平均可明顯逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的HK-2的EMT進(jìn)程，而且筆者發(fā)現(xiàn)與EMT密切相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail及Slug均受到羅格列酮的調(diào)控，為進(jìn)一步探索羅格列酮調(diào)控EMT的具體機(jī)制指出了方向，也是筆者繼續(xù)研究的內(nèi)容。

綜上所述，羅格列酮作為PPARγ激動(dòng)型配體，臨床治療中可以增加2型糖尿病患者對(duì)胰島素的敏感性，并且對(duì)糖尿病腎病有一定治療作用。研究表明，羅格列酮對(duì)腎臟的保護(hù)可能與其對(duì)TGF-β信號(hào)通路的抑制有關(guān)，但羅格列酮下調(diào)TGF-β緩解腎纖維化的具體機(jī)制尚不清楚，筆者通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羅格列酮可以逆轉(zhuǎn)TGF-β誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT，為羅格列酮應(yīng)用于臨床腎纖維化治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.007

Effect of Rosiglitazone on the Epithelial-mesenchymal Transition Process of Renal Tubu-lar Epithelial Cell

WANG Yin，HUANG Xiaomei，CHEN Wenli

(DepartmentofNephrology，WuhanCentralHospital，Wuhan430014，China)

Objective To investigate the effect of rosiglitazone on the epithelial-mesenchymal transition process of renal tubular epithelial cell induced by transforming growth factor-β(TGF-β). Methods The human renal tubular epithelial cell line HK-2 was culturedinvitroand treated with TGF-β at the presence or absence of rosiglitazone， and the morphological changes of HK-2 cells were observed.Then PPARγ,SMAD family number 2/3,E-cadherin and Vimentin were detected by western blot， and the mRNA expression of PPARγ， E-cadherin， Vimentin， zinc finger transcription factor Snail and Slug were measured by realtime quantitative PCR.Finally，dual luciferase reporter assay was performed to detect the effect of TGF-β and rosiglitazone on the transcription activity of E-cadherin promoter. Results TGF-β could induce the EMT process of HK-2, including morphological changes such as longer pseudopod and broader cell space.TGF-β also activated the SMAD2/3 signaling pathway, with expression changes of E-cadherin and Vimentin.Rosiglitazone reversed the morphological changes of HK-2 cells induced by TGF-β, with shorter pseudopod and narrower cell space.Rosiglitazone also inhibited the mRNA and protein expressions of Vimentin, and restored the mRNA and protein expression of E-cadherin by up-regulating PPARγ.The activity of E-cadherin promoter was enhanced under the treatment of rosiglitazone. Conclusion Rosiglitazone can antagonize the EMT process of renal tubular epithelial cell induced by TGF-β, through the activation of PPARγ and stimulating transcription and protein expression of E-cadherin.

Rosiglitazone; Transforming growth factor-β; Epithelial-mesenchymal transition; Renal fibrosis

2014-05-24

2014-06-15

王銀(1981-)，男，湖北武漢人，住院醫(yī)師，碩士，主要研究方向：血管通路及急慢性腎衰竭。

黃小妹(1971-)，女，安徽合肥人，副主任醫(yī)師，碩士，主要研究方向：血管通路及慢性纖維化性疾病。E-mail：878106214@qq.com。

R977.15；R965

A

1004-0781(2015)03-0310-04