柯鑫文，武政華，馮少勇，張 利，武進(jìn)峰，程 偉，成建軍，張建東，張雁鋼

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001)

·基礎(chǔ)研究·

茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響

柯鑫文1，武政華1，馮少勇1，張 利2，武進(jìn)峰2，程 偉2，成建軍2，張建東2，張雁鋼2

(1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)附屬山西大醫(yī)院泌尿外科，山西太原 030001)

目的 通過(guò)研究茶多酚對(duì)精索靜脈曲張大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響，探討茶多酚是否對(duì)精索靜脈曲張大鼠生精功能具有保護(hù)作用，為臨床上應(yīng)用茶多酚治療精索靜脈曲張?zhí)峁├碚撘罁?jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 32只雄性青春期Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。其中第Ⅰ組為假手術(shù)組(僅游離左腎靜脈，不結(jié)扎)；第Ⅱ組為模型組(建立精索靜脈曲張模型)；第Ⅲ、Ⅳ組為茶多酚干預(yù)組(先建立精索靜脈曲張模型，然后分別給予不同濃度的茶多酚干預(yù))。造模4周后，第Ⅰ組及第Ⅱ組均給予生理鹽水1 mL/100 g，第Ⅲ組給予茶多酚10 mg/kg[即:(1 mL鹽水+1 mg茶多酚)/100 g]，第Ⅳ組給予茶多酚40 mg/kg[即：(1 mL鹽水+4 mg茶多酚)/100 g]；1次/d，灌胃，持續(xù)4周。4周后4組大鼠均處死取左側(cè)睪丸組織，分別測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及檢測(cè)凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。結(jié)果 第Ⅰ組SOD活力最高，第Ⅱ組低于第Ⅲ組和第Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第Ⅰ組MDA含量最低，第Ⅲ、Ⅳ組低于第Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第Ⅰ組AI最低，第Ⅲ、Ⅳ組AI低于第Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 茶多酚能顯著降低精索靜脈曲張大鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，間接改善精索靜脈曲張大鼠睪丸的生精功能。

精索靜脈曲張；不育；茶多酚；氧化應(yīng)激；凋亡

精索靜脈曲張(varicocele,VC)是指精索內(nèi)靜脈因靜脈回流受阻或瓣膜功能不全致血液返流，使蔓狀靜脈叢迂曲、擴(kuò)張及伸長(zhǎng)，是青少年男性人群中一種常見(jiàn)的良性疾病。目前普遍認(rèn)為VC是導(dǎo)致成年男性不育最常見(jiàn)、最易糾正的病因。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，VC在普通男性人群中的發(fā)病率約為15%，在原發(fā)性不育中占21%～41%，在繼發(fā)性不育中占75%～81%[1]。盡管針對(duì)VC開(kāi)展的相關(guān)研究非常多，但具體的病理生理機(jī)制仍未完全闡明，目前研究的重點(diǎn)主要集中在細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。VC傳統(tǒng)的治療方式主要是手術(shù)，但單純手術(shù)的效果往往不很理想，尤其是精液質(zhì)量的改善上效果欠佳；因此改善VC患者睪丸生精功能的藥物研究成為近些年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

茶多酚(tea polyphenol,TP)是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，又名茶鞣質(zhì)，是茶葉中有保健功能的主要成分之一。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，TP具有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射、降血糖、降血脂及防治動(dòng)脈粥樣硬化等藥理學(xué)活性[2]。TP是天然的抗氧化劑，其抗氧化活性是維生素E的20倍[3]。諸多醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，茶多酚有極強(qiáng)的清除有害自由基及抑制質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化的作用。研究表明，每人每天攝入160 mg茶多酚即對(duì)人體內(nèi)亞硝化過(guò)程產(chǎn)生明顯的抑制和阻斷作用，攝入480 mg的茶多酚抑制作用達(dá)到最高[4]。本實(shí)驗(yàn)在建立VC動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上給予TP干預(yù)，觀察分析TP對(duì)大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性青春期Wistar大鼠32只，周齡6周左右，體重140～170 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 試劑與主要儀器 茶多酚(純度≥98.0%)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；SOD、MDA試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司；低溫超速離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制備 32只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組。其中第Ⅰ組為假手術(shù)組(僅游離左腎靜脈，不結(jié)扎)；第Ⅱ組為模型組(建立VC模型)；第Ⅲ、Ⅳ組為茶多酚干預(yù)組(先建立VC模型，然后分別給予不同濃度的茶多酚干預(yù))。模型的建立：按照經(jīng)典的Turner法[5]將直徑為0.7 mm自制的金屬桿與左腎靜脈一起結(jié)扎，然后拔出金屬桿，使左腎靜脈直徑縮小約一半，造模8周后開(kāi)腹，以左側(cè)精索內(nèi)靜脈明顯擴(kuò)張(直徑大于1 mm)且左腎無(wú)缺血萎縮為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模4周后，第Ⅰ組及第Ⅱ組均給予生理鹽水1 mL/100g；第Ⅲ組給予茶多酚10 mg/kg(即:1 mL鹽水+1 mg茶多酚)/100 g；第Ⅳ組給予茶多酚40 mg/kg(即:1 mL鹽水+1 mg茶多酚)/100 g；1次/d，灌胃，持續(xù)4周，其他飼養(yǎng)條件均一致。

1.2.3 標(biāo)本的采集 灌胃4周后4組大鼠均處死取左側(cè)睪丸組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗，洗凈睪丸上的血液，用濾紙擦干，沿睪丸中軸縱行切開(kāi)成兩半；一半放入Borrin液中固定，48 h后石蠟包埋；另一半放入-80℃冰箱中凍存。

1.2.4 組織勻漿的制備 從-80℃冰箱中取出凍存的睪丸組織，常溫下解凍片刻，用眼科剪剪取0.1 g組織放入EP管中，并用眼科剪剪碎組織，加入900 μL預(yù)冷生理鹽水，放入冰水浴中用超聲勻漿機(jī)充分勻漿，冰水浴中靜置10 min，以2 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液制成10%組織勻漿，用于SOD活力及MDA含量的測(cè)定。

1.2.5 SOD活力及MDA含量的測(cè)定 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，先采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定10%、1%組織勻漿中蛋白的濃度，然后分別采用羥胺法和TBA法測(cè)定SOD活力及MDA含量。

1.2.6 凋亡檢測(cè) 將蠟塊切成4 μm厚度切片，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作，采用原位脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)凋亡細(xì)胞,細(xì)胞核染成棕色為陽(yáng)性。將組織切片置于40×10倍光學(xué)顯微鏡下觀察,每張切片均隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,求得陽(yáng)性細(xì)胞率即為凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用多個(gè)樣本均數(shù)的單因素方差分析進(jìn)行組間比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 TP對(duì)VC大鼠睪丸組織SOD活力及MDA含量的影響 第Ⅰ組SOD活力最高，第Ⅱ組明顯低于第Ⅲ組和第Ⅳ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。第Ⅰ組MDA含量最低，第Ⅲ、Ⅳ組明顯低于Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 生精細(xì)胞的凋亡 第Ⅰ組偶見(jiàn)棕褐色的生精細(xì)胞凋亡，第Ⅱ組可見(jiàn)大量棕褐色凋亡的生精細(xì)胞，第Ⅲ、Ⅳ組可見(jiàn)少量生精細(xì)胞凋亡(圖1)；第Ⅰ組AI最低，第Ⅲ、Ⅳ組AI顯著低于第Ⅱ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

組別SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)AI(%)Ⅰ85．14±2．64?1．74±0．23?5．13±0．37?Ⅱ54．07±2．34#5．11±0．38#26．94±1．04#Ⅲ67．60±2．333．48±0．1919．56±0．95Ⅳ72．86±2．19△2．46±0．17△11．33±0．65△

*與其他3組比較，P<0.05；#與Ⅲ、Ⅳ組較，P<0.05；△與第Ⅲ組比較，P<0.05。

圖1 生精細(xì)胞凋亡圖像(TUNEL,×400，陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕褐色)

A:第Ⅰ組;B:第Ⅱ組;C:第Ⅲ組:D:第Ⅳ組。

3 討 論

VC是泌尿外科常見(jiàn)的一種良性疾病，是成年男性不育的主要原因之一，其導(dǎo)致不育的確切病理生理機(jī)制仍未完全闡明。已經(jīng)提出了一系列相關(guān)假說(shuō)，如：睪丸溫度升高、微循環(huán)障礙、細(xì)胞凋亡異常、氧化應(yīng)激、缺氧和CO2蓄積、毒素返流、性激素的改變、自身免疫、NO的作用及附睪損害等[6]，但沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能完全闡明其確切機(jī)制，可能是通過(guò)多種途徑共同作用所致，其中細(xì)胞凋亡異常和氧化應(yīng)激起主要作用[7]。細(xì)胞凋亡是基因編碼的細(xì)胞程序性死亡，是機(jī)體維持細(xì)胞群體數(shù)量穩(wěn)態(tài)的重要手段，是維持機(jī)體生理狀態(tài)的主要調(diào)節(jié)方式之一。正常生精過(guò)程中有25%～75%的生精細(xì)胞發(fā)生凋亡，以此來(lái)維持生精細(xì)胞與支持細(xì)胞的適當(dāng)比例，從而保證正常的生育能力[8]。當(dāng)發(fā)生VC時(shí)，陰囊局部溫度升高、血液中代謝毒物濃度增加、氧化應(yīng)激及免疫作用等多種因素均會(huì)誘發(fā)生精細(xì)胞過(guò)度凋亡，并且具有時(shí)間依從性[9]。SIMSEK等[10]通過(guò)TUNEL法測(cè)定生精細(xì)胞AI后發(fā)現(xiàn)VC組和對(duì)照組分別為14.7%和2%?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species,ROS)是一類具有高度反應(yīng)活性的含氧基團(tuán)，生理?xiàng)l件下機(jī)體可產(chǎn)生少量受控的ROS，它是精子獲能、頂體反應(yīng)等生理功能所必需的。同時(shí)機(jī)體內(nèi)還存在抗氧化防御體系，主要包括一些抗氧化酶，如SOD、過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathyione peroxidase,GSH-Px)等，生理狀態(tài)下氧化/抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡。VC時(shí)，由于ROS產(chǎn)生過(guò)多或抗氧化體系功能缺失均會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，使氧化/抗氧化系統(tǒng)呈現(xiàn)負(fù)平衡；過(guò)量的ROS一方面可以直接損傷生精細(xì)胞。另一方面通過(guò)誘發(fā)生精細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生大量MDA，進(jìn)一步破壞生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使其形態(tài)發(fā)生改變，產(chǎn)生功能及代謝異常，從而間接損傷生精細(xì)胞。ALLAMANENI等[11]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)VC患者睪丸中ROS含量明顯升高，且升高程度與VC的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。ABD-ELMOATY等[12]通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)患有VC的不育患者精液中的SOD、CAT、GSH-Px活性明顯低于正常對(duì)照組，MDA含量顯著高于對(duì)照組，這表明氧化應(yīng)激可能是VC致不育的原因之一。因?yàn)樯?xì)胞凋亡異常增多可以導(dǎo)致少精子癥或無(wú)精子癥，而氧化應(yīng)激可以通過(guò)破壞生精細(xì)胞DNA的完整性使生精細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致精子活力減弱，生育力下降或不育，所以細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激可以間接反映VC對(duì)睪丸生精功能的影響[7]。

VC對(duì)機(jī)體的最大損害是導(dǎo)致不育，傳統(tǒng)的治療方式首選手術(shù)，但治療效果往往欠佳，尤其是精液質(zhì)量的改善，VC患者術(shù)后精液的改善率為65%[13]。鑒于此，許多學(xué)者對(duì)改善VC所致不育患者生精功能的藥物進(jìn)行了相關(guān)研究，CAM等[14]發(fā)現(xiàn)，維生素E可以明顯降低VC大鼠睪丸組織中的ROS水平，使生精細(xì)胞凋亡減少。ABBSI等[15]研究發(fā)現(xiàn)氨基胍(一種NO合酶抑制劑)通過(guò)阻斷NO的合成間接抑制ROS的產(chǎn)生，并減少生精細(xì)胞DNA的碎裂，從而改善生精功能。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)抗氧化藥物的研究主要集中在中成藥：崔云等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通精靈能顯著降低實(shí)驗(yàn)性VC大鼠生精細(xì)胞的凋亡；安立文、吳育鋒及梁志剛等[17-19]均證實(shí)生精沖劑對(duì)VC大鼠睪丸組織具有保護(hù)作用；尹靜等[20]通過(guò)研究證實(shí)強(qiáng)精膠囊能改善VC大鼠精子密度及活力。因此，利用抗氧化劑改善VC患者的生精功能受到了臨床醫(yī)生的廣泛關(guān)注。

茶多酚是從茶葉提取的一種天然抗氧化劑，根據(jù)目前的研究水平，它的抗氧化作用機(jī)制主要通過(guò)以下4個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：①直接清除ROS：TP結(jié)構(gòu)中的酚羥基可提供活潑氫使活性氧還原成三線態(tài)氧而滅活,而本身則被氧化成具有較穩(wěn)定的酚氧自由基。②抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)：病理?xiàng)l件下，體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的ROS極易損害細(xì)胞膜脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸,形成脂自由基,引起膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。TP不僅可以直接清除脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的中間產(chǎn)物脂過(guò)氧自由基和烷氧自由基從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，還能通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生間接抑制脂質(zhì)過(guò)氧化[21]。③絡(luò)合金屬離子：金屬離子是體內(nèi)代謝反應(yīng)中各種酶的重要輔助因子，為酶發(fā)揮活性所必需。在中性或酸性條件下,茶多酚的鄰位二酚羥基對(duì)過(guò)渡態(tài)金屬離子有較強(qiáng)的絡(luò)合作用，從而阻止金屬離子對(duì)ROS等自由基的生成和膜脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的催化作用。④激活細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)：生理狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)作為清除自由基的第一道防線可及時(shí)清除體內(nèi)過(guò)剩的ROS,維持自由基的動(dòng)態(tài)平衡。TP可以促進(jìn)和調(diào)動(dòng)體內(nèi)抗氧化酶的活性間接作用于自由基，使機(jī)體免受氧化應(yīng)激的損傷。TP的抗氧化活性已經(jīng)在心、腦、肺、腎等器官中得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[3]，另外TP對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)/復(fù)位大鼠生精細(xì)胞的保護(hù)作用也已得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)[22]，但TP對(duì)VC睪丸生精功能的保護(hù)作用研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。SOD是體內(nèi)經(jīng)典的抗氧化酶之一，它可以專一性地清除體內(nèi)的ROS。MDA是ROS通過(guò)損傷質(zhì)膜誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的重要中間代謝產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜具有毒害作用。因此測(cè)定SOD活性及MDA含量既可以直接反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，又可以間接反應(yīng)細(xì)胞損傷的程度，即SOD活性及MDA含量可以反映細(xì)胞受氧化應(yīng)激損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)中，第Ⅱ組SOD活力最低，可能是過(guò)量的ROS消耗了大量SOD所致，而第Ⅲ、Ⅳ組SOD活力明顯高于第Ⅱ組，因?yàn)門P既可以直接激活抗氧化防御系統(tǒng)使SOD產(chǎn)生增多和活力增強(qiáng)，還能通過(guò)清除ROS減少SOD的消耗間接實(shí)現(xiàn);另外，第Ⅳ組SOD活力高于第Ⅲ組，但由于茶多酚干預(yù)組分組太少，只能說(shuō)明TP的抗氧化作用與給藥濃度可能呈正相關(guān)。第Ⅲ、Ⅳ組MDA含量明顯低于第Ⅱ組，可能與TP顯著抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)有關(guān)。試驗(yàn)中第Ⅲ、Ⅳ組AI顯著低于第Ⅱ組，一方面可能是TP在體內(nèi)發(fā)揮極強(qiáng)的抗氧化作用，從而抑制生精細(xì)胞的凋亡，另一方面可能是TP參與凋亡的生精細(xì)胞DNA的修復(fù)[23]。

本試驗(yàn)表明，茶多酚通過(guò)顯著降低VC大鼠睪丸組織的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，間接改善VC大鼠睪丸的生精功能，并且可能與茶多酚的濃度呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明茶多酚應(yīng)用于臨床上治療VC的不育患者具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但茶多酚對(duì)VC生精功能保護(hù)作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，并探索茶多酚的最佳干預(yù)時(shí)間及最佳給藥劑量，為臨床上治療VC提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯 何宏靈)

The effects of tea polyphenol on the oxidative stress and cellular apoptosis of testicular tissues in rat varicocele

KE Xin-wen1, WU Zheng-hua1, FENG Shao-yong1, ZHANG Li2, WU Jin-feng2, CHENG Wei2, CHENG Jian-jun2, ZHANG Jian-dong2, ZHANG Yan-gang2

(1.the First Clinical Medical College, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001; 2.Department of Urology, Shanxi Dayi Hospital Affiliated to Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China)

Objective To explore the protective role of tea polyphenol on the oxidative stress and cellular apoptosis of testicular tissues in experimentally-induced varicocele rat models.Methods A total of 32 male prepubertal Wistar rats were randomly divided into 4 groups, with 8 rats in each group. Group I was the sham operation group. Group Ⅱ was the varicocele model group. Group Ⅲ and Ⅳ were the tea polyphenol groups, in which the varicocele models were treated with tea polyphenol of different concentrations. Four weeks after the models were established, group I and Ⅱ were fed with 1 mL/100 g normal saline, group Ⅲ and Ⅳ were fed with 10 mg/kg and 40 mg/kg tea polyphenol respectively. After being fed once every day for 4 weeks, all rats were executed and the left testes were collected to detect the vitality of superoxide dismutase (SOD), content of malondialdehyde (MDA), and the apoptosis index (AI). Results Group I showed the highest vitality of SOD, followed by group Ⅱ,Ⅲ and Ⅳ (P<0.05). Group II had the highest measurement of MDA and AI, followed by group Ⅲ,Ⅳ and Ⅰ (P<0.05). Conclusion Tea polyphenol can significantly reduce the oxidative stress and cellular apoptosis of testicular tissues, indirectly improving the spermatogenesis in rats.

varicocele; infertility; tea polyphenol; oxidative stress; apoptosis

2014-12-01

2015-02-11

山西省衛(wèi)生廳科研資助項(xiàng)目(No.201201047)

張雁鋼，主任醫(yī)師.E-mail:urozyg@163.com

柯鑫文(1988-)，男(漢族)，在讀碩士.研究方向：泌尿男科學(xué).E-mail:kxwweneal@126.com

R698

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2015.07.017