武萍萍，陶然，彭攸，趙衛(wèi)衛(wèi)，劉萃萃，王璐璐，胡朝暉，王玉平，孫振亮，馮景

EZH2及DNMT1在三陰性乳腺癌中的表達及意義

武萍萍，陶然，彭攸，趙衛(wèi)衛(wèi)，劉萃萃，王璐璐，胡朝暉，王玉平，孫振亮，馮景

目的探討EZH2及DNMT1在三陰性乳腺癌中的表達特點及與主要臨床病理參數的關系。方法采用免疫組化SP法，檢測131例三陰性乳腺癌、78例非三陰性乳腺癌及65例癌旁組織中EZH2及DNMT1的表達情況。采用多因素logistic回歸分析EZH2及DNMT1陽性表達有關的因素，Spearman等級相關分析三陰性乳腺癌中EZH2及DNMT1表達的相關關系。結果EZH2蛋白在三陰性乳腺癌組織、非三陰性乳腺癌組織和癌旁組織的陽性表達率分別為86.3%、89.7%和40.0%；DNMT1蛋白在三種組織中的陽性表達率分別為63.4%、66.6%和44.6%；兩種蛋白在乳腺癌組織中的表達均高于癌旁組織(P<0.05)；兩種蛋白在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌組織間表達差異無統(tǒng)計學意義。在三陰性乳腺癌中，EZH2陽性表達與腫瘤組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結是否轉移有關(P<0.05)，DNMT1的表達與腫瘤組織學分級、淋巴結是否轉移有關(P<0.05)。多因素logistic回歸分析顯示，腫瘤組織學分級為影響EZH2及DNMT1表達的最主要因素；三陰性乳腺癌中DNMT1與EZH2的表達呈正相關(r=0.34，P<0.01)。結論EZH2與DNMT1的高表達與三陰性乳腺癌的分化、生長、轉移有關，且兩者在三陰性乳腺癌中的表達呈正相關，其聯合檢測可能對三陰性乳腺癌的預后判斷更有價值。

乳腺腫瘤；組蛋白甲基轉移酶同源序列2增強子；DNA甲基轉移酶1；免疫組織化學

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體2亞型(Her-2)表達均為陰性的乳腺癌。這類乳腺癌約占所有乳腺癌的10%～17%[1-3]，具有發(fā)病年輕、轉移早、腫瘤體積大、診斷時分期晚、無病生存率及總生存率低等特征[4]。與非三陰性乳腺癌(non-triple-negative breast cancer，NTNBC)相比，TNBC的病理組織學分級更高[5]，且內分泌治療及靶向治療對這類腫瘤一般無效。近年來研究表明，表觀遺傳學機制在三陰性乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。組蛋白甲基轉移酶同源序列2增強子(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是新近認識的基因[6-7]，可催化組蛋白H3的第27位氨基酸K27發(fā)生三甲基化(H3K27Me3)。EZH2不僅可以募集DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)在基因甲基化過程中起調控作用[8]，還可沉默抑癌基因的表達，促進多種腫瘤轉移[9]。本研究通過觀察影響DNA甲基化的關鍵酶EZH2及DNMT1在三陰性乳腺癌中的表達情況，探索其與三陰性乳腺癌的發(fā)生及臨床病理特征的關系，為三陰性乳腺癌的早期診斷和治療探索新的腫瘤標志物及治療靶點。

1 資料與方法

1.1 標本收集 廣州金域醫(yī)學檢驗中心2008年1月至2013年5月乳腺癌病理資料較齊全的石蠟標本209例，癌旁乳腺組織65例(距離腫瘤邊緣4cm以上)。所有病例均按WHO(2003年)乳腺腫瘤分類標準進行病理學分型。其中病理證實為三陰性乳腺癌的標本131例，包括浸潤性導管癌101例、浸潤性小葉癌12例、乳腺黏液癌5例、乳腺腺癌4例、導管原位癌4例、髓樣癌1例、混合型浸潤性導管癌浸潤性小葉癌1例、大汗腺癌1例、浸潤性微乳頭狀癌1例、Pagets病1例；非三陰性乳腺癌78例，包括浸潤性導管癌59例、浸潤性小葉癌8例、乳腺黏液癌4例、浸潤性微乳頭狀癌2例、乳腺腺癌2例、導管原位癌2例、乳腺小管癌1例?；颊呔鶠榕裕挲g24～89歲，其中，乳腺癌組49.4±12.3歲，三陰性乳腺癌組48.1±11.6歲。所有患者術前未做化療、免疫或放射等抗腫瘤治療。

1.2 主要試劑及方法 兔抗人單克隆抗體EZH2(稀釋濃度1:400)購自cellsignal公司；DNMT1單克隆抗體(1:200)購自Abcam公司；PBS緩沖液(pH7.2)、EDTA Tris抗原修復液(pH7.4)、3%H2O2均購自Novocastra公司。

1.3 實驗方法 采用免疫組化SP法染色，石蠟標本切片，脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10min滅活內源性過氧化物酶，正常山羊血清室溫封閉20min，加入兔抗人單克隆抗體EZH2(稀釋濃度1:400)或DNMT1單克隆抗體(1:200)后4℃過夜，加入二抗37℃孵育1h，DAB顯色，蘇木素復染，依次脫水、透明，封固后在光鏡下觀察。以PBS代替一抗作為空白對照，扁桃體淋巴細胞或正常子宮肌瘤肌層作為陰性對照，使用之前確認的乳腺癌樣本做陽性對照。所有切片的免疫組化染色均在同一條件下完成。染色結果由兩位病理醫(yī)師進行雙盲閱片判斷。要求顯微鏡下每個400倍視野至少有200個可用于評價的細胞。EZH2、DNMT1蛋白定位于細胞核，突出于背景的棕黃色大小不等顆粒判讀為陽性。依據染色強度及該強度下陽性細胞比例進行計分。無染色計0分；弱染色：在40×物鏡視野才能看到細胞染色，計1分；強染色：在4×或10×物鏡視野能看到的細胞染色，計3分；中等染色：介于強與弱之間的染色，計2分；HSCORE=∑(I×PC)，其中I代表染色強度(0、1、2、3)，PC代表在每個強度被染色細胞的比例，HSCORE>30為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數據處理。同一指標在不同組織中的表達及與不同臨床病理特征的關系采用χ2檢驗。采用多因素logistic回歸分析EZH2和DNMT1陽性表達的影響因素，兩種蛋白表達的相關性采用spearman相關分析。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 EZH2、DNMT1在不同乳腺癌組織中的表達EZH2及DNMT1蛋白定位于細胞核，突出于背景的棕黃色顆粒即為陽性表達(圖1)。EZH2在三陰性乳腺癌組織、非三陰性乳腺癌組織、癌旁組織中的陽性表達率分別為86.3%、89.7%、40.0%，EZH2在三陰性與非三陰性乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DNMT1蛋白在三陰性乳腺癌組織、非三陰性乳腺癌組織和癌旁組織中的陽性表達率分別為63.4%、66.6%、44.6%。EZH2與DNMT1在三陰性與非三陰性乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EZH2及DNMT1在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表1)。

圖1 EZH2及DNMT1在乳腺癌與癌旁組織中的表達(免疫組化 ×400)Fig.1 Expression of EZH2 and DNMT1 in breast cancer tissue (IHC ×400)

表1 EZH2、DNMT1在三種組織中的表達差異(例)Tab.1 Different expression of EZH2 and DNMT1 in the three tissues (case)

2.2 三陰性乳腺癌中EZH2的表達與患者臨床病理參數的關系 三陰性乳腺癌患者中，EZH2陽性表達與患者腫瘤直徑、淋巴結轉移、組織學分級有關(P<0.05)，與患者腫瘤組織類型、年齡、絕經狀態(tài)、脈管神經浸潤無關(P>0.05)；DNMT1表達與腫瘤組織學分級、淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者腫瘤直徑、組織類型、年齡、絕經狀態(tài)、脈管神經浸潤均無關(P>0.05，表2)。

2.3 三陰性乳腺癌中EZH2及DNMT1表達的多因素logistic回歸分析 如表3和表4所示，將經過篩選的影響EZH2及DNMT1陽性表達的因素分別代入logistic模型進行多因素回歸分析。結果顯示腫瘤組織學分級、腫瘤大小與EZH2陽性表達關系密切(P<0.05)，組織學分級是影響EZH2及DNMT1陽性表達最主要因素。

2.4 三陰性乳腺癌中EZH2與DNMT1表達的相關性 三陰性乳腺癌中EZH2與DNMT1表達均陽性者79例，均陰性者14例，spearman等級相關分析發(fā)現兩者表達呈正相關(表5)。

3 討 論

EZH2定位于染色體7q35上，是果蠅zeste基因增強子[E(z)]的人類同源基因，也是polycombgroup基因家族的重要成員[10]。它可以通過改變核小體、重塑染色質以及與其他轉錄因子相互作用影響基因的轉錄調控，在胚胎發(fā)育、細胞增殖及細胞周期調節(jié)中起重要作用[11]。近年來研究發(fā)現EZH2在前列腺癌、膀胱癌、肝細胞癌中呈過度表達[12-13]，有學者認為它與這些腫瘤的進程、侵襲性、轉移能力密切相關[14]。同其他腫瘤一樣，乳腺癌的發(fā)生、演進是多基因表達調控失衡的共同結果，其中DNA甲基化與其關系最為密切。研究基因甲基化對乳腺癌的病因、診斷以及治療具有深遠意義[15]。組蛋白甲基化在DNA甲基化的建立和維護中發(fā)揮重要作用[16]。EZH2作為PRC2(polycombrepressive complex)蛋白復合體的核心組分，與EED、SUZ2等形成多梳抑制型復合物后發(fā)揮組蛋白甲基轉移酶的作用，催化組蛋白的甲基化修飾。三陰性乳腺癌的病因及發(fā)病機制尚未完全明了，EZH2介導的組蛋白甲基化和DNMT1催化的DNA甲基化也許可以為研究ER、PR、Her-2的表達沉默機制提供新的線索。

文獻報道，在乳腺癌的惡變過程中EZH2蛋白表達明顯上調，使得轉移抑制相關基因和轉移促進相關基因之間的表達平衡偏向轉移促進。本研究顯示，209例乳腺癌中EZH2陽性表達率(82.8%)明顯高于癌旁組織(40.0%)，但未發(fā)現EZH2在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌中的表達存在差異，這與Gong、姚凡等[17-18]的研究結果不一致，分析原因可能在于：①乳腺癌本身存在高度異質性；②對于免疫組化結果的判讀國內外尚未形成統(tǒng)一標準，對最終統(tǒng)計結果可能有影響；③本研究中非三陰性乳腺癌樣本相對不足。Kleer等[19]通過細胞學研究顯示，將EZH2注入裸鼠乳腺脂肪墊后，可使細胞產生致瘤性。Bachmann等[20]研究亦發(fā)現，EZH2表達量的異常升高與乳腺癌侵襲性和增殖能力密切相關。本研究發(fā)現，EZH2陽性與陰性表達組在組織學級別、腫瘤大小、淋巴結轉移等方面的差異有統(tǒng)計學意義；進一步對影響EZH2表達的因素進行l(wèi)ogistic回歸分析，結果提示組織學分級及腫瘤大小與EZH2密切相關，其中組織學分級為最主要因素，提示EZH2陽性表達率可反映三陰性乳腺癌的細胞分化程度，EZH2表達增高者預后則差。

表2 三陰性乳腺癌中EZH2及DNMT1的表達與臨床病理特征的關系Tab. 2 Correlation between the expression of EZH2, DNMT1 and clinical pathological significance in TNBC

表3 三陰性乳腺癌中EZH2表達的多因素logistic回歸分析Tab. 3 Multivariate logistic regression analysis for EZH2 in TNBC

表4 三陰性乳腺癌中DNMT1表達的多因素logistic回歸分析Tab. 4 Multivariate logistic regression analysis for DNMT1 in TNBC

表5 三陰性乳腺癌中EZH2和DNMT1表達的相關性(例)Tab. 5 Correlation between the expression of EZH2 and DNMT1 in TNBC (case)

基因組DNA的甲基化依賴DNMT的催化[21]。DNA甲基化異常的一個潛在機制就是DNMT發(fā)生過調節(jié)，DNMT的活化和高表達是癌細胞特征性的早期分子改變[22]。哺乳動物細胞中已知有活性的DNMT有3種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。Fernandez等[23]研究認為DNMT1同時具有重頭甲基化和維持甲基化作用。大量研究表明，多種抑癌基因的失活和表達降低均與其啟動子區(qū)域的高甲基化狀態(tài)有關[24-26]。這些基因與細胞周期的調控、DNA的損傷修復、腫瘤新生血管生成、分化、凋亡、耐藥性和浸潤轉移等密切相關。目前，尚未發(fā)現關于DNMT1在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌及癌旁組織中表達情況的研究。王文軍等[27]的研究表明DNMT1在食管癌組織中的表達顯著高于癌旁組織。李艷華等[28]的研究顯示DNMT1在乳腺癌中的表達顯著高于癌旁組織，在ERα陰性乳腺癌組織中的表達高于ERα陽性乳腺癌組織。本研究亦顯示DNMT1在乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織，但在三陰性乳腺癌與非三陰性乳腺癌組織中的表達無明顯差異。本研究還發(fā)現三陰性乳腺癌中DNMT1的表達與腫瘤組織學分級及淋巴結轉移相關，對影響DNMT1表達的因素進行l(wèi)ogistic回歸分析，結果提示腫瘤組織學分級與DNMT1關系最為密切，提示DNMT1陽性表達率亦可反映三陰性乳腺癌的分化程度，DNMT1過表達者惡性度可能更高。

鑒于兩者均與基因甲基化修飾密切相關，本研究進一步探討了二者在三陰性乳腺癌中表達的相關性，結果顯示兩者表達呈正相關，表明EZH2與DNMT1可能存在協(xié)同性。EZH2與DNMT1表達均與腫瘤分級密切相關，提示二者可能共同影響腫瘤細胞的分化。Vire等[29]的研究發(fā)現，在以EZH2為核心成員組成的PRC2蛋白參與下，EZH2可直接與DNMT1結合并影響DNMT1的活性，最終導致CpG島甲基化。綜上所述，DNMT1催化的PcG的高度甲基化和EZH2催化的H3K27組蛋白甲基化緊密相關，兩者共同作用可能促使抑癌基因甲基化沉默并最終導致癌癥的發(fā)生。

本研究的不足之處在于未將非三陰性乳腺癌中ER、PR、Her-2單一指標陰性和相互組合陰性樣本進行再次分類。增加非三陰性乳腺癌樣本量，細化非三陰性乳腺癌分組，與三陰性乳腺癌同病理類型樣本進行對比分析可進一步揭示EZH2及DNMT1對沉默基因表達的作用。三陰性乳腺癌是一類高度異質性的疾病，目前仍無理想的治療方法。了解患者EZH2及DNMT1的表達情況可能有助于早期預測三陰性乳腺癌的病情及預后，對三陰性乳腺癌患者的早期診斷和治療有重要參考價值。

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Expression and significance of EZH2 and DNMT1 in triple-negative breast cancer

WU Ping-ping1, TAO Ran3, PENG You2, ZHAO Wei-wei2, LIU Cui-cui2, WANG Lu-lu2, HU Chao-hui3, WANG Yuping2, SUN Zhen-liang2, FENG Jing2*1Third Clinical College, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
2Department of Clinical Laboratory, Fengxian Hospital, Southern Medical University, Shanghai 201400, China
3Guangzhou Kingmed Center for Clinical Laboratory, Guangzhou 510330, China

*Corresponding author, E-mail: fengjing8801530@163.com

This work was supported by Natural Science Foundation of Shanghai (12ZR1426300), Shanghai Medical Excellent Discipline Leader Training Program (XBR20130114)

ObjectiveTo probe into the expression features of EZH2 and DNMT1 in triple-negative breast cancer (TNBC), and the relations between the expression and the main clinical pathological parameters of TNBC.MethodsThe clinical and pathological data of 209 cases of breast cancer (including 131 cases of TNBC and 78 cases of non-TNBC) in Guangzhou Kingmed Center for Clinical Laboratory from Jan. 2008 to May 2013 were retrospectively analyzed. Immunohistochemistry SP assay was performed to determine the expressions of EZH2 and DNMT1 in 209 paraffin-embedded specimens of breast cancer and 65 specimens of normal tissue (more than 4cm away from tumor). The differences of protein expression in the specimens were compared, and correlation analysis was performed to disclose the relationship between protein expression and clinico-pathological indices. Multivariate logistic regression analysis was applied to analyze the positive expression-related factor of EZH2 and DNMT1. Spearman rank correlation analysis was used to analyse the interrelation of EZH2 and DNMT1 in TNBC.ResultsThe positive expression rates of EZH2 in TNBC, non-TNBC and adjacent breast tissue were 86.3%, 89.7% and 40.0%, respectively, while the positive expression rates of DNMT1 were 63.4%, 66.6% and 44.6%, respectively. The positive expression rates of EZH2 and DNMT1 were higher in both TNBC and non-TNBC tissues than in adjacent breast tissue (P<0.05), but no significant difference in expression rate between the TNBC tissues and non-TNBC tissues. There was no relationship between EZH2 expression and age, menstrualstatus, histologic type and vessel and nerve invasion (P>0.05), but the positive expression of EZH2 in TNBC was related to the pathological grade, tumor size and lymph node metastasis (P<0.05), and the positive expression of DNMT1 was related to the pathological grade and lymph node metastasis (P<0.05). Multivariate logistic regression analysis demonstrated that the pathological grade of tumor was the main factor affecting the expressions of EZH2 and DNMT1, and the expressions of EZH2 and DNMT1 in TNBC were positively correlated (r=0.34,P<0.01). Conclusion The high expressions of EZH2 and DNMT1 are correlated with the differentiation, growth and metastasis of TNBC. Combined detection of the expressions of EZH2 and DNMT1 may be more valuable in determination of prognosis of patients with TNBC.

breast neoplasms; enhancer of zeste homolog 2; DNA methyltransferase 1; immunohistochemistry

R737.9

A

0577-7402(2015)01-0050-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.01.11

?2014-08-21；

2014-11-20)

(責任編輯：沈寧)

上海市自然基金項目(12ZR1426300)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學科帶頭人培養(yǎng)計劃(XBR20130114)

武萍萍，碩士研究生。主要從事乳腺癌的臨床與基礎研究

510515 廣州 南方醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院(武萍萍)；201400 上海 南方醫(yī)科大學附屬奉賢醫(yī)院檢驗科(彭攸、趙衛(wèi)衛(wèi)、劉萃萃、王璐璐、王玉平、孫振亮、馮景)；510330 廣州 廣州金域醫(yī)學檢驗中心有限公司(陶然、胡朝暉)

]馮景，E-mail：fengjing8801530@163.com