高愛君，司維柯，趙宸，吳韋銣

聚凝胺增強(qiáng)Ror2重組腺病毒感染K562細(xì)胞效應(yīng)的研究

高愛君，司維柯，趙宸，吳韋銣

目的探索應(yīng)用聚凝胺(polybrene)試劑增強(qiáng)Ror2重組腺病毒對(duì)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的技術(shù)。方法在K562細(xì)胞中分別加入0～12μl Ror2重組腺病毒，摸索最佳重組腺病毒用量；同時(shí)加入0～5μg/ml polybrene和最佳重組腺病毒用量，培養(yǎng)1～3d后，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)，對(duì)比加入polybrene前后被感染的細(xì)胞數(shù)。臺(tái)盼藍(lán)染色觀察重組腺病毒引起K562細(xì)胞死亡的情況。采用RT-PCR和Western blotting檢測(cè)Ror2基因的表達(dá)情況。結(jié)果Polybrene濃度為3μg/ml和重組腺病毒8μl時(shí)，感染效果最佳，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，實(shí)驗(yàn)組感染效果是對(duì)照組的17倍；加入polybrene后，外源性Ror2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增高。結(jié)論P(yáng)olybrene能顯著增強(qiáng)重組腺病毒感染K562細(xì)胞的作用，并能高效表達(dá)外源性Ror2基因，該法簡(jiǎn)便、價(jià)廉、有效，是血液疾病分子生物學(xué)研究的一個(gè)良好策略。

聚凝胺；腺病毒科；K562細(xì)胞；基因，ror2

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562中，Ror2可能是一種白血病抑制受體，但它在K562細(xì)胞中發(fā)揮的作用及具體機(jī)制尚不明確[1]，目前國(guó)內(nèi)外也未見相應(yīng)報(bào)道。要開展這方面的研究，首先需要將Ror2基因?qū)隟562細(xì)胞。目前導(dǎo)入基因的方法主要有生物學(xué)方法、化學(xué)方法和物理方法。相比之下，生物學(xué)方法對(duì)細(xì)胞損傷小，導(dǎo)入效率高，被廣泛采用。生物學(xué)方法通常采用病毒作為基因載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺病毒載體。慢病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入的基因可整合到細(xì)胞的基因組序列中，所以有潛在致病風(fēng)險(xiǎn)，且導(dǎo)入細(xì)胞的拷貝數(shù)不高，基因表達(dá)變化不明顯，且不易感染終末期或增殖慢的細(xì)胞，制備也相對(duì)煩瑣。腺病毒載體因相對(duì)穩(wěn)定，感染滴度較高，能轉(zhuǎn)染非增殖細(xì)胞，成為廣泛使用的轉(zhuǎn)基因工具。但在實(shí)際應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)一些懸浮細(xì)胞(如白血病細(xì)胞)，它的感染率較低。

多聚陽(yáng)離子聚合物1,5-二甲基-1,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)可作為輔助試劑中和細(xì)胞和病毒顆粒表面的唾液酸，消除靜電排斥，促進(jìn)兩者間的相互作用，從而提高重組腺病毒的感染效率。本文探討polybrene的最佳用量，與病毒的最佳配比劑量以及作用時(shí)間，使其能增強(qiáng)Ror2重組腺病毒感染K562細(xì)胞的效率，且不影響細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，而且導(dǎo)入Ror2的基因可高效表達(dá)具有生物活性的Ror2蛋白，旨在為Ror2與白血病發(fā)生關(guān)系及其機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)，為血液疾病的基因研究提供價(jià)廉物美、簡(jiǎn)便快速的技術(shù)和方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，Tripure試劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司)，PCR試劑盒(美國(guó)Roche公司)，Ror2抗體(美國(guó)Cell Signaling公司)，HRP標(biāo)記羊抗兔lgG、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，DMSO、polybrene(美國(guó)Sigma公司)。polybrene工作液(1mg/ml)配制：0.1g polybrene溶解于100ml PBS溶液中，充分混勻，置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 重組腺病毒和細(xì)胞來源 重組Ror2腺病毒由美國(guó)芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心，分子腫瘤研究室何通川教授惠贈(zèng)。K562細(xì)胞來自本實(shí)驗(yàn)室保存，置于含5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 重組腺病毒最佳用量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 在24孔板中加入1ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個(gè)培養(yǎng)狀態(tài)良好的K562細(xì)胞懸液，分別加入0～12μl的重組Ror2腺病毒，培養(yǎng)2d后，熒光倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(5HP)中被感染的細(xì)胞數(shù)；并加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)100μl，使臺(tái)盼藍(lán)終濃度為0.04%，立即于牛鮑氏計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，3min內(nèi)完成，顯微鏡下著藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)即為死亡細(xì)胞數(shù)(個(gè)/ml)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。分別以熒光細(xì)胞數(shù)(個(gè)/5HP) 為縱坐標(biāo)，重組腺病毒用量(μl)作為橫坐標(biāo)作圖；以死亡細(xì)胞數(shù)作為縱坐標(biāo)，腺病毒用量(μl)作為橫坐標(biāo)作圖。最佳重組腺病毒用量定義為：熒光細(xì)胞數(shù)最多、細(xì)胞死亡數(shù)最少所對(duì)應(yīng)的病毒用量。

1.4 Polybrene最佳濃度的確定 在6孔板中分別加入3ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的K562細(xì)胞懸液，加入前述實(shí)驗(yàn)確定的最佳重組Ror2腺病毒用量，再分別加入1mg/ml polybrene工作液0～15μl，使終濃度為0～5μg/ml，每組需設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)2d后，分別計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下被感染的細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/5HP)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次，取平均值。以熒光細(xì)胞數(shù)對(duì)polybrene最佳濃度(μg/ml)作坐標(biāo)圖。以熒光細(xì)胞數(shù)最多所對(duì)應(yīng)的polybrene終濃度為最佳濃度。

1.5 Polybrene最佳作用時(shí)間的確定 在6孔板中分別加入3ml DMEM高糖培養(yǎng)基和1×105個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的K562細(xì)胞懸液，加入以上實(shí)驗(yàn)確定的最佳重組Ror2腺病毒用量和最佳polybrene用量作為實(shí)驗(yàn)組，只加入最佳重組Ror2腺病毒用量作為對(duì)照組，培養(yǎng)1～3d后，分別計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下被感染的細(xì)胞總數(shù)(個(gè)/5HP)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3次，取平均值。以熒光細(xì)胞數(shù)對(duì)polybrene最佳作用時(shí)間(d)做坐標(biāo)圖。以熒光細(xì)胞數(shù)最多所對(duì)應(yīng)時(shí)間為最佳作用時(shí)間。

1.6 外源性Ror2基因表達(dá)的鑒定

1.6.1 RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中Ror2 mRNA的表達(dá)聯(lián)用polybrene和重組腺病毒作為實(shí)驗(yàn)組，單用Ror2重組腺病毒作為對(duì)照組，分別感染細(xì)胞2d后，RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中采用Tripure RNA 分離試劑提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 的A260/A280值并計(jì)算濃度，參照RT-PCR試劑盒說明書加入1μg總RNA，建立20μl RT反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系25μl，Ror2上游引物：5'-CTCATGATCGAGTGCTGGAA-3'，下物引物：5'-CGTTGCTCACATTGCTCACT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物274bp；GAPDH上游引物：5'-CATCACCATCTTCC AGGAGCG-3'，下游引物：5'-TGACCTTGCCCACAG CCTTG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物443bp。擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性5min；94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共循環(huán)38次；72℃ 延伸7min，最后取20μl擴(kuò)增產(chǎn)物于1.6%瓊脂凝膠電泳并照相和圖像處理。

1.6.2 Western blotting檢測(cè)Ror2蛋白的表達(dá) 將聯(lián)用polybrene和重組腺病毒處理作為實(shí)驗(yàn)組，單用Ror2重組腺病毒作為對(duì)照組。感染細(xì)胞2d后，加入總蛋白裂解液(RIPA裂解液)，冰上裂解30min，4℃，12 000×g離心10min，收集上清，用BCA法測(cè)量蛋白濃度。將定量后的蛋白以每個(gè)上樣孔50μg上樣，于10%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，半干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉液封閉，室溫封閉1h，TBST 洗膜后，加1:1000稀釋的Ror2一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST洗去一抗后，加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗，室溫?fù)u床孵育1～2h，TBST洗膜后，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色，凝膠成像儀暗室顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒最佳用量的確定 每孔加入2～8μl重組腺病毒時(shí)，隨著用量的增加， 熒光細(xì)胞數(shù)逐漸增多，當(dāng)加入8μl時(shí)，與不加重組腺病毒的對(duì)照組相比明顯增多(P<0.05)；與8μl組相比，加入10μl組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；當(dāng)大于10μl時(shí)，熒光細(xì)胞數(shù)明顯降低，因此8μl重組腺病毒感染細(xì)胞最多(圖1)。臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示：重組腺病毒用量為1～8μl時(shí)均未引起細(xì)胞死亡，但9μl以上的濃度可使細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增加，達(dá)1×104(個(gè)/ml)，與不加重組腺病毒的對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示病毒用量不宜大于8μl(圖2)。最終結(jié)果表明：8μl為重組腺病毒的最佳用量，此時(shí)感染細(xì)胞最多，且無細(xì)胞死亡。

圖1 重組腺病毒最佳用量確定(熒光顯微鏡)Fig. 1 The optimal dosage of recombinant adenovirus infection (Fluorescence microscopy)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

圖2 重組腺病毒對(duì)細(xì)胞死亡的影響(臺(tái)盼藍(lán)染色法)Fig. 2 Effect of recombinant adenovirus on cell death (Trypan blue staining)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

2.2 增強(qiáng)重組腺病毒感染K 5 6 2細(xì)胞的最佳polybrene作用濃度 未加polybrene的重組腺病毒感染效率較低，加入polybrene，被感染細(xì)胞明顯增多(圖3)。隨著polybrene濃度增加，感染細(xì)胞數(shù)逐漸增加。當(dāng)polybrene終濃度增加到3μg/ml后，感染細(xì)胞數(shù)達(dá)260個(gè)/5HP，是polybrene對(duì)照組(15個(gè)/5HP)的17倍(P<0.01)，是polybrene處理組(2μg/ml)的1.2倍(P<0.05)。而polybrene濃度增加到4μg/ml時(shí)，感染細(xì)胞數(shù)略有下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖3 Polybrene 增強(qiáng)重組腺病毒感染K562細(xì)胞(×200)Fig. 3 The infection efficiency of recombinant adenovirus was enhanced by polybrene (×200)The morphology of K562 cells treated without polybrene under fluorescence microscope(A,B) and those with polybrene (C,D)

圖4 Polybrene增強(qiáng)重組腺病毒感染的最適濃度Fig. 4 The optimal concentration of polybrene that enhances the infection efficiency of recombinant adenovirus(1)P<0.01 compared with the control group without polybrene; (2)P<0.05 compared with 2μg/ml polybrene treated group

2.3 Polybrene增強(qiáng)重組腺病毒感染K562細(xì)胞最佳作用時(shí)間的確定 polybrene作用第1天，感染細(xì)胞數(shù)為260個(gè)/5HP，第2天為325個(gè)/5HP，第2天感染細(xì)胞數(shù)是第1天的1.25倍(P<0.05)。第3天感染細(xì)胞數(shù)下降為62個(gè)/5HP，第2天感染細(xì)胞數(shù)目是第3天的5.24倍(P<0.05，圖5)。所以選擇polybrene感染2d作為最佳作用時(shí)間。

2.4 Polybrene增強(qiáng)重組腺病毒導(dǎo)入Ror2基因mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè) 最佳polybrene終濃度為3μg/ml和最佳的腺病毒8μl感染K562細(xì)胞2d后，分別提取Ror2的mRNA和蛋白行RT-PCR和Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Ror2 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加(圖6)。

3 討 論

Ror2是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體2，屬于Ⅰ型受體酪氨酸激酶(RTK)家族成員，是一類膜受體，它在多種腫瘤中的作用已有報(bào)道，如在骨肉瘤[2]、腎細(xì)胞癌[3]、黑色素瘤[3-4]中高表達(dá)，其作用類似癌基因。而在部分腫瘤中，Ror2卻具有抑癌作用，如在鼻咽癌、胃癌[4]、肝癌[5]中表達(dá)下調(diào)。Ror2在白血病中的研究尚不清楚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a是一種白血病抑制因子[6-7]，它可上調(diào)Ror2，且可優(yōu)勢(shì)性結(jié)合Ror2受體而不是LRP6受體，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt5a/Ror2非經(jīng)典信號(hào)通路，抑制Wnt/β-catenin通路(即Wnt經(jīng)典通路)，從而發(fā)揮抑癌作用[8]。近來報(bào)道認(rèn)為，Wnt5a發(fā)揮何種生物學(xué)功能，如抑癌或促癌，與其結(jié)合何種受體有關(guān)，即所謂的受體途徑，與細(xì)胞類型有關(guān)。本課題組的預(yù)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)外源性Ror2比過表達(dá)Wnt5a有更強(qiáng)的抑制K562細(xì)胞增殖作用，如前者誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而后者沒有凋亡發(fā)生。這個(gè)問題引發(fā)了研究“Ror2與白血病關(guān)系”的興趣，而將Ror2基因?qū)氚籽〖?xì)胞，制作過表達(dá)Ror2白血病細(xì)胞模型是研究的關(guān)鍵。導(dǎo)入基因常用的方法有脂質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)法和病毒載體感染法，其中病毒感染法對(duì)細(xì)胞損傷小、導(dǎo)入基因效率高[9]，故病毒載體是目前應(yīng)用最廣泛的轉(zhuǎn)基因載體，如反轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒和重組腺病毒載體，選用何種病毒載體常取決于細(xì)胞種類和病毒特性。重組腺病毒載體與反轉(zhuǎn)錄和慢病毒相比具有以下優(yōu)勢(shì)：①宿主范圍廣，對(duì)人致病性低；②在增殖與非增殖細(xì)胞中均可感染和表達(dá)基因；③能有效地增殖并且滴度高，且能在懸浮培養(yǎng)液中擴(kuò)增；④與人類基因同源性高；⑤不整合到染色體中，無插入致突變風(fēng)險(xiǎn)，安全性較好?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，我們選擇了重組腺病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)。實(shí)驗(yàn)為解決病毒感染血液細(xì)胞效率不高這一血液腫瘤研究領(lǐng)域共同面臨的技術(shù)難題[10-11]，我們?cè)梅崔D(zhuǎn)錄病毒制作穩(wěn)定表達(dá)Ror2的K562細(xì)胞株，但細(xì)胞株增殖減慢甚至難以存活。

圖5 Polybrene增強(qiáng)重組腺病毒感染的最佳時(shí)間Fig. 5 The optimal time of recombinant adenovirus infection enhanced by polybrene(1)P<0.05 compared with the first day; (2)P<0.05 compared with the third day

圖6 polybrene增強(qiáng)Ror2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)Fig. 6 mRNA and protein expression of Ror2 was enhanced by polybreneA. RT-PCR; B. Western blotting; 1. Polybrene(+); 2. Polybrene(-)

Polybrene是一種多聚陽(yáng)離子聚合物，最早應(yīng)用在交叉配血中，因?yàn)槠淇芍泻图t細(xì)胞表面唾液酸所帶的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞表面Zeta電位降低，細(xì)胞易發(fā)生凝集，減少了交叉配血假陽(yáng)性，有助于避免輸血反應(yīng)的發(fā)生[12]。有報(bào)道認(rèn)為病毒顆粒和被感染細(xì)胞表面帶有相同的負(fù)電荷，排斥作用使病毒難導(dǎo)入基因[13]。采用polybrene中和細(xì)胞表面和病毒顆粒上唾液酸的電荷，消除排斥作用，即可增強(qiáng)病毒的轉(zhuǎn)染效率[14-18]。本課題組曾采用polybrene輔助重組腺病毒感染間充質(zhì)干細(xì)胞，大大提高了轉(zhuǎn)入外源性基因的效率，簡(jiǎn)便而高效地開展了骨再生分子生物學(xué)方面的研究[15]。本研究將該技術(shù)應(yīng)用于難轉(zhuǎn)染的血液細(xì)胞，在血液疾病分子生物學(xué)研究領(lǐng)域具有更重要的應(yīng)用價(jià)值。

本課題探討了polybrene作為輔助試劑，增強(qiáng)Ror2重組腺病毒感染K562細(xì)胞的作用，并摸索了它與重組腺病毒的最佳搭配濃度，最佳作用時(shí)間以及對(duì)細(xì)胞死亡的影響，并檢測(cè)導(dǎo)入目的基因Ror2在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。研究結(jié)果表明，8μl重組腺病毒和 3μg/ml polybrene濃度，對(duì)于1×105個(gè)K562細(xì)胞是最佳的用量和最佳的組合，最佳作用時(shí)間是2d。應(yīng)用polybrene后，感染細(xì)胞數(shù)是對(duì)照的17倍，表明polybrene明顯促進(jìn)了重組腺病毒感染細(xì)胞的效率，且在一定的濃度范圍內(nèi)有劑量依賴性。3μg/ml polybrene是輔助重組腺病毒感染細(xì)胞的最佳、最安全的劑量。采用RT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)了在最佳重組腺病毒用量、最佳polybrene濃度和最佳感染時(shí)間下，Ror2在mRNA和蛋白水平表達(dá)均增高，表明polybrene增強(qiáng)了Ror2基因的導(dǎo)入。

綜上，polybrene能安全有效地增強(qiáng)重組腺病毒的感染效果，并高效導(dǎo)入目的基因Ror2。polybrene價(jià)廉、安全，是一種良好的導(dǎo)入外源性基因的輔助試劑，研究結(jié)果較好地解決了白血病細(xì)胞等難感染細(xì)胞的基因?qū)腚y題，為血液腫瘤基因的研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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Polybrene enhances infection effect of Ror2 recombinant adenovirus on K562 cells

GAO Ai-jun,SI Wei-ke*,ZHAO Chen,WU Wei-ru
Department of Clinical Hematology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: weikesi2004@hotmail.com

,E-mail: weikesi2004@hotmail.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81370624)

ObjectiveTo explore a new technique to enhance the efficiency of Ror2 recombinant adenovirus infecting K562 cell line with polybrene.MethodsRecombinant adenovirus Ror2 (AdRor2,0-12μl) was added to K562 cells to look for the optimal dose of recombinant adenovirus. At the same time,polybrene (0-5μg/ml) and optimal dose of recombinant adenovirus were added to K562 cells. The infected cells were counted under fluorescence microscope after they were cultured 1-3 days,and the comparative study was performed between cells treated and not treated by polybrene. The influence of AdRor2 on the death of cells was investigated by trypan blue staining,and the expression of Ror2 gene was assessed with Western blotting and RTPCR.ResultsIt was found that the infection effect was optimal when the concentration of polybrene was 3μg/ml and the recombinant adenovirus was 8μl,and there was little effect on the cell growth. mRNA and protein expression of exogenous Ror2 were significantly elevated.ConclusionsPolybrene can significantly enhance the infection capability of recombinant adenovirus on K562 cells,and it can also effectively express the exogenous Ror2 gene. This technique is simple,inexpensive and effective,thus providing a good strategy for molecular biology research in the field of blood diseases.

polybrene; adenoviridae; K562 cells; genes,ror2

R331.1；R34；R-331

A

0577-7402(2015)12-0976-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.08

2015-07-20；

2015-10-27)

(責(zé)任編輯：沈?qū)?

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81370624)

高愛君，碩士研究生。主要從事白血病抑癌基因方面的研究

400038 重慶 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床血液學(xué)教研室(高愛君、司維柯、趙宸、吳韋銣)

司維柯，E-mail：weikesi2004@hotmail.com