胡佑帆，曾 彪，朱 敏，2，陳玉保，彭國(guó)平

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410127）

苧麻根中綠原酸的提取工藝研究

胡佑帆1，曾 彪1，朱 敏1，2，陳玉保1，彭國(guó)平1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128；2.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410127）

對(duì)苧麻根中綠原酸的提取工藝進(jìn)行了研究。以綠原酸提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。確定了苧麻根中綠原酸的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶13（g∶mL）、提取溫度90℃、提取溶液pH值5、提取時(shí)間100min，在此條件下，綠原酸的提取率為0.2759%。

苧麻根；綠原酸；提取工藝

苧麻為蕁麻科苧麻屬植物，原產(chǎn)于中國(guó)，種質(zhì)資源十分豐富?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，苧麻除作為重要的纖維作物外，還具有極其重要的藥用及保健價(jià)值。苧麻葉中含有綠原酸，綠原酸是選擇性羥基自由基和過(guò)氧自由基的清除劑，對(duì)抗腫瘤、抗衰老以及心、肝、肺、皮膚、血液等方面疑難疾病具有重大的意義［1－2］。

針對(duì)苧麻根中活性成分提取工藝的研究報(bào)道較少，作者在此研究了苧麻根中的藥理活性成分綠原酸的提取條件，擬為苧麻根中綠原酸提取的工業(yè)化提供指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

苧麻根，采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園苧麻基地。

95%乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、甲醇，均為分析純；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；蒸餾水。

FW177型中草藥粉碎機(jī)；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；電熱恒溫水浴鍋；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵；R-1001N型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；WB-2000型水浴鍋；Agilent-8453E型紫外可見分光光度計(jì)，德國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將苧麻根洗凈，切片，攤開放入烘箱45℃烘2～3d，于中草藥粉碎機(jī)中粉碎成粉末，收集、封存、備用。

1.2.2 提取工藝研究

1.2.2.1 提取溶劑的選擇

稱取5.0g苧麻根粉末2份，按料液比1∶10（g∶mL，下同）、自然pH值分別加入蒸餾水和70%乙醇溶液，在80℃下加熱回流提取2h，提取2次，用布氏抽濾器減壓過(guò)濾浸提液，浸提液定容到100mL，測(cè)定OD值，選定提取溶劑［3－4］。

1.2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以綠原酸提取率為考察指標(biāo)，以4.0g苧麻根粉末為原料，分別改變乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶7、1∶10、1∶13、1∶16、1∶19）、提取溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）、提取溶液pH值（1、3、5、7、9、11）、提取時(shí)間（20min、40min、60min、80min、100min）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)［5］。

1.2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)［6］，確定苧麻根中綠原酸的最佳提取條件。正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

1.2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取100g苧麻根粉末，按正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.000mg溶于15.836g甲醇中，配制0.1mg·mL－1綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5 mL、0.6mL、0.8mL置于6支干凈試管中，補(bǔ)加甲醇至5mL，配制成濃度分別為4.000μg·mL－1、6.000 μg·mL－1、8.000μg·mL－1、10.000μg·mL－1、12.000μg·mL－1、16.000μg·mL－1的綠原酸溶液，以甲醇為對(duì)照，在327nm處測(cè)定吸光度［7］，以吸光度（OD）對(duì)進(jìn)樣濃度（c）進(jìn)行線性回歸分析，得綠原酸線性回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 各個(gè)濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的OD值Tab.2 The ODvalues of various concentrations of chlorogenic acid standard

以吸光度（OD）對(duì)進(jìn)樣濃度（c）進(jìn)行線性回歸分析，得綠原酸線性回歸方程為：c＝13.15OD＋0.2968，R2＝0.999。

式中：n為稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；m為苧麻根質(zhì)量，g。

2.2 提取溶劑的確定

由于苧麻根粉末含有大量非水溶性糖類和膠體，在水提過(guò)程中，溶液變得極其黏稠，無(wú)法分離；而乙醇溶液可以很好地溶解苧麻根粉末中的物質(zhì)，提取物能正常檢測(cè)，因此選用乙醇溶液作為提取溶劑。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響（圖1）

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of chlorogenic acid

由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，苧麻根粉末難以溶解，提取率較低；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%時(shí)，苧麻根粉末溶解性明顯增大，提取率升高；隨后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率又逐漸降低。故確定最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

2.3.2 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響（圖2）

圖2 料液比對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

由圖2可知，當(dāng)料液比較?。慈軇┝枯^多）時(shí)提取率較高，可能是料液比過(guò)小時(shí)大量的雜質(zhì)影響了檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)料液比減小（即溶劑量增加），提取率呈先下降后上升的趨勢(shì)，在料液比為1∶10時(shí)，提取率最低。結(jié)合成本考慮，確定最佳料液比為1∶19。

2.3.3 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響（圖3）

圖3 提取溫度對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of chlorogenic acid

由圖3可知，當(dāng)提取溫度過(guò)低時(shí)，提取率偏低；隨著提取溫度的升高，提取率相應(yīng)上升，在70℃達(dá)到峰值后又開始下降；在提取溫度超過(guò)80℃后，提取率又有所提高。綜合能耗考慮，確定最佳提取溫度為70℃。

2.3.4 提取溶液pH值對(duì)綠原酸提取率的影響（圖4）

圖4 提取溶液pH值對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of pH value of extraction solution on extraction rate of chlorogenic acid

由圖4可知，當(dāng)提取溶液pH值為1時(shí)，綠原酸提取率達(dá)到最大，隨著pH值的升高，綠原酸提取率下降，并且在pH值為7左右時(shí)達(dá)到拐點(diǎn)，隨后提取率趨于穩(wěn)定。故確定最佳提取溶液pH值為1。

2.3.5 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響（圖5）

圖5 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of chlorogenic acid

由圖5可知，在提取時(shí)間為20min時(shí)，由于提取不完全，綠原酸提取率不高，提取時(shí)間為40min時(shí)，提取率達(dá)到峰值；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，由于雜質(zhì)變多、綠原酸分解，導(dǎo)致提取率下降。故確定最佳提取時(shí)間為40min。

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（表3）

由表3可知，綠原酸最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶13、提取溫度90℃、提取溶液pH值5、提取時(shí)間100min，綠原酸提取率為0.2759%。各因素中，影響綠原酸提取率的主次順序依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取溫度＞提取溶液pH值＞料液比＞提取時(shí)間。方差分析見表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiment

表4 方差分析Tab.4 Analysis of between-subjects effects

由表4可知，提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溶液pH值的F值分別為：2.588、1.191、1.526、1.390，相應(yīng)的P值為0.228、0.445、0.368、0.397，均大于0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各個(gè)因素之間沒(méi)有顯著差別。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表5）

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of checking test

由表5可知，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綠原酸提取率為0.1202%，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比提取率有所下降。這可能是因?yàn)?，在放大?shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)了提取不夠充分，過(guò)程損失量變大。

3 結(jié)論

對(duì)苧麻根中綠原酸的提取工藝進(jìn)行了研究，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、料液比1∶13、提取溫度90℃、提取溶液pH值5、提取時(shí)間100min，在此條件下，綠原酸提取率為0.2759%；放大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)綠原酸提取率為0.1202%，較正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所下降。本實(shí)驗(yàn)得出了實(shí)驗(yàn)室苧麻根中綠原酸提取的最佳條件，可為苧麻根中綠原酸提取的工業(yè)化提供指導(dǎo)。

［1］熊維新，李開泉.苧麻的藥用開發(fā)價(jià)值［J］.江西中醫(yī)學(xué)院報(bào)，2006，18（3）：51-52.

［2］陳國(guó)慶，劉艷麗，謝茜，等.苧麻根化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2009，40（5）：683-686.

［3］趙琰玲，尹蓮.金銀花化學(xué)成分與有效成分提取研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，26（5）：521-523.

［4］施樹云，鐘世安，任秀蓮，等.苧麻葉中綠原酸的提取［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（1）：73-77.

［5］楊麗芬.牛勞葉綠原酸提取工藝、分離純化及對(duì)病原真菌的活性研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2007.

［6］李春喜.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2008.

［7］景曉明，楊學(xué)軍，趙莉，等.金銀花中綠原酸的分離與測(cè)定方法［J］.西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，32（6）：1181-1184.

HU You-fan1，ZENG Biao1，ZHU Min1，2，CHEN Yu-bao1，PENG Guo-ping1

（1.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha410128，China；2.Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic，Changsha410127，China）

Study on Extraction Process of Chlorogenic Acid from Ramie Root

The extraction process of chlorogenic acid from ramie root was studied.Using extraction rate of chlorogenic acid as evaluation index，the extraction conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.Results showed that，the optimum extraction conditions of chlorogenic acid from ramie root were as follows：ethanol volume fraction was 50%，solid-liquid ratio was 1∶13（g∶mL），extraction temperature was 90℃，pH value of extraction solution was 5，extraction time was 100min.Under above conditions，extraction rate of chlorogenic acid was 0.2759%.

ramie root；chlorogenic acid；extraction process

TQ 461 R 284.2

A

1672-5425（2015）03-0045-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.03.011

2014-10-23

胡佑帆（1987－），男，湖南常德人，碩士研究生，研究方向：中草藥資源應(yīng)用生物技術(shù)，E-mail：thedayisours＠163.com；通訊作者：彭國(guó)平，博士，副教授，E-mail：pgphh＠163.com。