王 丹,于肖夏,鞠天華,于 卓*,郝治滿(mǎn),姜 超
(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,呼和浩特010019;2 赤峰天澤生物科技有限公司,內(nèi)蒙古赤峰025457)
馬鈴薯是重要糧、菜、飼兼用作物,也是重要工業(yè)和能源原料。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、酚類(lèi)物質(zhì)及鉀、鋅、硒、硫等營(yíng)養(yǎng)元素[1-3]。隨著中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展,專(zhuān)用型
和深加工型馬鈴薯品種的選育工作倍受重視[4-6]。內(nèi)蒙古是中國(guó)重要的馬鈴薯種薯和商品薯生產(chǎn)基地。目前生產(chǎn)上運(yùn)用的馬鈴薯品種對(duì)水肥條件要求較高,但其田間抗病能力弱,種薯退化周期短,特別是黑痣病、粉痂病、晚疫病等病害危害嚴(yán)重,馬鈴薯產(chǎn)量損失逐年增大[7-10]。因此,選育抗病性和適應(yīng)性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)馬鈴薯品種非常必要。
通過(guò)分析比對(duì)子代與親本在DNA 水平上的差異,可為馬鈴薯優(yōu)良株系(或品系)選育和鑒定提供分子依據(jù)。如李長(zhǎng)青等[11]利用3對(duì)SSR 適宜引物建立了3個(gè)馬鈴薯雜交組合共59個(gè)雜種株系的指紋圖;甘霖等[12]利用ISSR 標(biāo)記技術(shù)成功的鑒定了4個(gè)馬鈴薯雜交組合選出的23 個(gè)優(yōu)良雜種株系。段艷鳳等[13]利用6對(duì)SSR 引物將88份彩色馬鈴薯材料一一區(qū)分開(kāi)來(lái)。馬鈴薯雜種株系花粉育性是判斷其是否可作為雜交中間材料而進(jìn)一步利用的重要細(xì)胞學(xué)依據(jù),一般花粉可育率高于50%的雜種材料可作為父本利用,而低于50%適于作母本利用[14]。馬鈴薯雜種染色體配對(duì)行為與花粉育性的高低密切相關(guān),通常二價(jià)體頻率越高,表明染色體遺傳相對(duì)穩(wěn)定,相應(yīng)的花粉育性亦越高[15]。
本課題組從美國(guó)引進(jìn)了馬鈴薯材料‘MB09’(四倍體,2n=4x=48),并在內(nèi)蒙古呼和浩特和赤峰地區(qū)種植觀(guān)察發(fā)現(xiàn),其產(chǎn)量高,品質(zhì)好,生育期較短,薯形好,但其抗病性差。國(guó)內(nèi)育成品種‘隴薯7號(hào)’(四倍體,2n=4x=48)具有抗病性和適應(yīng)強(qiáng)、淀粉含量高、芽眼淺等優(yōu)良特性,但生育期較長(zhǎng)。為培育出抗病性和抗逆性強(qiáng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的馬鈴薯新品種,我們按照遺傳差異較大和優(yōu)缺點(diǎn)互補(bǔ)的親本組配原則,用‘MB09’材料作母本,‘隴薯7號(hào)’作父本,人工去雄授粉雜交,成功獲得‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1代共1 035個(gè)單株材料;通過(guò)田間試驗(yàn)觀(guān)測(cè),從中選出生長(zhǎng)健壯、田間抗病性和適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良株系20個(gè)(無(wú)性系一代),進(jìn)而對(duì)這20個(gè)雜種株系進(jìn)行產(chǎn)量和品質(zhì)等農(nóng)藝性狀測(cè)定分析,選出優(yōu)異株系8個(gè)(無(wú)性系二代)。本試驗(yàn)采用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)‘MB09’ב隴薯7 號(hào)’的20 個(gè)雜種株系進(jìn)行DNA 指紋分析,并利用花粉染色鏡檢及卡寶品紅染色體制片方法對(duì)其選出的8個(gè)優(yōu)異株系的花粉育性及花粉母細(xì)胞染色體配對(duì)構(gòu)型進(jìn)行觀(guān)察,為進(jìn)一步馬鈴薯雜交新品系選育提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。
材料為馬鈴薯‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1中選出的優(yōu)良株系F1-1~F1-20(無(wú)性系一代)及從這20個(gè)株系中選出的株系F1-1、F1-2、F1-7、F1-11、F1-13、F1-14、F1-15和F1-20共8個(gè)優(yōu)異株系(無(wú)性系二代)和其親本。8個(gè)雜種株系的田間抗病性均較強(qiáng),株型、薯型和生長(zhǎng)勢(shì)好,芽眼淺,還原糖含量均很低(鮮薯含量小于0.1%)。其中株系F1-7為高淀粉株 系(22.21%),株 系F1-2 和F1-20為 高 蛋 白 株 系(2.73%和2.96%),株系F1-11和F1-13均為高產(chǎn)株系(單株平均產(chǎn)量1.44kg和1.55kg)。各材料均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯育種研究中心提供。
1.2.1 DNA 提取與純度檢測(cè) 在苗期,選取22份馬鈴薯材料的幼嫩葉片,用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組試劑盒提取DNA,1.6%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 純度后,將各材料的DNA 濃度稀釋到50ng/μL 左右,置冰箱中保存?zhèn)溆谩?2個(gè)馬鈴薯材料的基因組DNA 電泳條帶清晰均勻,無(wú)拖尾現(xiàn)象,DNA 純度高,符合SSR 分析的要求。
表1 SSR-PCR反應(yīng)體系Table 1 SSR-PCR reaction system
表2 SSR 適宜引物及其堿基序列Table 2 SSR suitable primers and their nucleotide sequences
1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序 SSR 擴(kuò)增反應(yīng)體系詳見(jiàn)表1。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性1個(gè)循環(huán),時(shí)間為4min;94℃變性30s,56℃退火45s,72 ℃延伸90s,34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10min,1個(gè)循環(huán)后終止反應(yīng)[12]。試驗(yàn)所用PCR 儀為Bio-rad T00Thermal Cycler。
1.2.3 電泳及銀染 對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,PAGE 凝膠濃度為6%,樣孔加樣量6μL,Marker為DL100,功率70W,電泳時(shí)間1h。電泳完畢后將膠板放入固定液(蒸餾水2L、酒精200mL、冰乙酸20mL)中固定15min,蒸餾水漂洗3min,用1.5%AgNO3溶液染色15min后放入蒸餾水中速漂5s,置顯影液(蒸餾水2L、NaOH 60g、甲醛10mL)中顯色10min,蒸餾水漂洗,自然晾干后掃描膠板[14]。
1.2.4 SSR 適宜引物篩選 用親本及其20個(gè)雜種F1無(wú)性株系的基因組DNA 為模板篩選SSR 適宜引物,試驗(yàn)所用的40對(duì)SSR 引物堿基序列來(lái)源于NCBI網(wǎng)站公布的馬鈴薯特異性引物,委托上海生工有限公司合成。通過(guò)PCR 擴(kuò)增從中選出多態(tài)性豐富、條帶清晰穩(wěn)定的2對(duì)SSR 適宜引物(表2)。
在馬鈴薯開(kāi)花盛期,田間隨機(jī)取親本及其8個(gè)優(yōu)異雜種株系的花藥帶回室內(nèi)鏡檢。在載玻片上用鑷子擠壓花藥,使花粉散出,滴加1.0%的醋酸洋紅,在OlympusBX51的10×10倍顯微鏡下觀(guān)察并統(tǒng)計(jì)可育花粉和不可育花粉數(shù),每份材料觀(guān)察50個(gè)視野左右。觀(guān)察標(biāo)準(zhǔn):可育花粉染色深、花粉粒較大、飽滿(mǎn)、形狀有規(guī)則;不育花粉染色淺或者是沒(méi)有染上色、花粉空癟、形狀無(wú)規(guī)則?;ǚ劭捎剩?)=(可育花粉??倲?shù)/觀(guān)察的花粉??倲?shù))×100%[15]。
在馬鈴薯現(xiàn)蕾初期,取8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其雙親的幼小花蕾若干,置于裝有卡諾液(無(wú)水乙醇∶冰醋酸=3∶1)的廣口瓶中,4℃冰箱中固定22~24 h后,用清水洗凈放入70%酒精中保存?zhèn)溆?。制片時(shí),在載玻片上用解剖針將花蕾挑開(kāi)擠出花藥,去除雜質(zhì),滴加卡寶品紅染色,放蓋玻片用鑷子輕敲,使細(xì)胞分散均勻后壓片,Olympus BX51 顯微鏡下觀(guān)察統(tǒng)計(jì)PMCMⅠ染色體數(shù)并照相[16]。
利用篩選出的SSR 引物C57和S25對(duì)20個(gè)雜種株系及其親本PCR 擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。20個(gè)株系的SSR 指紋圖與雙親間均產(chǎn)生互補(bǔ)型條帶及新的特征帶或缺失型條帶,其中引物C57擴(kuò)增出互補(bǔ)型條帶及新的特征帶的株系為F1-1~F1-3、F1-5、F1-7~F1-20,擴(kuò)增出缺失型條帶的為F1-4和F1-6;引物S25擴(kuò)增出互補(bǔ)型條帶及新的特征帶的株系為F1-1、F1-2、F1-4~F1-6、F1-9~F1-20,擴(kuò)增出缺失型條帶的為F1-3、F1-7和F1-8。這從DNA 水平證明它們均為真實(shí)的雜種株系。另外,株系F1-12和F1-17的SSR 指紋一致,說(shuō)明引物C57能把90%的雜種株系識(shí)別出來(lái),而引物S25擴(kuò)增的SSR 指紋圖可將這20個(gè)株系完全區(qū)別開(kāi)來(lái)。由于不同引物在雜種株系間擴(kuò)增出的SSR 指紋圖不完全相同,因此在馬鈴薯雜種株系鑒定及DNA 指紋圖建立時(shí)最好選用2對(duì)以上引物。
圖1 引物C57(A)和S25(B)對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1 無(wú)性株系擴(kuò)增的SSR 指紋圖M.DL100DNA;P1.‘MB09’;P2.‘隴薯7號(hào)’;1~20.‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1Fig.1 SSR fingerprint of F1hybrid lines from‘MB09’בLongshu 7’amplified by primer C57(A)and S25(B)M.DL100DNA;P1.‘MB09’;P2.‘Longshu 7’;1-20.F1hybrid lines of‘MB09’בLongshu 7’
8個(gè)雜交株系間的花粉可育率不同,株系F1-1、F1-13、F1-14間差異不顯著,但它們與株系F1-2、F1-7、F1-15、F1-20間均達(dá)到極顯著差異(圖2和表3)。父本‘隴薯7號(hào)’花粉育性為83.33%,母本‘MB09’為20.45%(最低),其中F1-7 的花粉育性 最高,達(dá)87.08%,且與其母本差異極顯著;其余優(yōu)異株系的花粉可育率變幅為36.73%~77.78%,介于雙親之間。根據(jù)8個(gè)株系育性程度,在今后的雜種育種中可作為中間材料進(jìn)一步利用,其中株系F1-1、F1-13、F1-14和F1-15適于作母本利用,而株系F1-2、F1-7、F1-11和F1-20適宜作父本利用。
表3 8個(gè)雜種株系及其親本花粉育性Table 3 The pollen fertility of 8hybrid lines and their parents
圖2 8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其親本的花粉育性P1.‘隴薯7號(hào)’;a.F1-1;b.F1-2;c.F1-7;d.F1-11;e.F1-13;f.F1-14;g.F1-15;h.F1-20;P2.‘MB09’Fig.2 The pollen fertility of 8excellent hybrid lines and their parents P1.‘Longshu 7’;a.F1-1;b.F1-2;c.F1-7;d.F1-11;e.F1-13;f.F1-14;g.F1-15;h.F1-20;P2.‘MB09’
圖3 8個(gè)優(yōu)異雜種株系及其親本的PMCMⅠ染色體配對(duì)行為1.‘隴薯7號(hào)’;2.F1-1;3.F1-2;4.F1-7;5.F1-11;6.F1-13;7.F1-14;8.F1-15;9.F1-20;10.‘MB09’Fig.3 The chromosome pairing behavior of 8excellent hybrid lines and their parents at PMCMⅠ1.‘Longshu 7’;2.F1-1;3.F1-2;4.F1-7;5.F1-11;6.F1-13;7.F1-14;8.F1-15;9.F1-20;10.‘MB09’
表4 8個(gè)雜種株系及親本花粉母細(xì)胞分裂中期ⅠPMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型Table 4 Chromosome configuration of 8hybrid lines and their parents at PMCMⅠ
親本間的PMCMⅠ染色體配對(duì)構(gòu)型差異明顯(圖3和表4)。其中母本MB09 的二價(jià)體頻率較低,且棒狀二價(jià)體較多,染色體配對(duì)構(gòu)型為12.11Ⅰ+3.93Ⅱ+3.74Ⅲ+4.21Ⅳ;父本隴薯7號(hào)的二價(jià)體頻率較高,且以環(huán)狀二價(jià)體為主,染色體配對(duì)構(gòu)型為1.25Ⅰ+13.52Ⅱ+0.94Ⅲ+4.42Ⅳ。
與雙親相比,8個(gè)優(yōu)異雜種株系的染色體配對(duì)構(gòu)型明顯不同。株系F1-2、F1-7、F1-11和F1-20的二價(jià)體頻率為72.38%~82.91%,與父本(80.36%)接近,并以株系F1-7(82.91%)最高,且以環(huán)狀二價(jià)體為主,其染色體配對(duì)構(gòu)型分別為2.01Ⅰ+12.15Ⅱ+3.67Ⅲ+2.67Ⅳ、1.42Ⅰ+14.63Ⅱ+1.13Ⅲ+3.48Ⅳ、1.96Ⅰ+13.47Ⅱ+1.85Ⅲ+3.38Ⅳ和2.36Ⅰ+11.66Ⅱ+3.83Ⅲ+2.71Ⅳ;株系F1-1、F1-13、F1-14和F1-15的二價(jià)體頻率為49.13%~62.18%,介于雙親之間,并均以棒狀二價(jià)體為主,其染色體配對(duì)構(gòu)型分別為4.75Ⅰ+9.79Ⅱ+4.98Ⅲ+2.18Ⅳ、5.67Ⅰ+8.80Ⅱ+5.15Ⅲ+2.32Ⅳ、5.03Ⅰ+9.53Ⅱ+5.20Ⅲ+2.08 Ⅳ和7.12Ⅰ+7.36Ⅱ+6.31Ⅲ+1.81Ⅳ。將該結(jié)果進(jìn)一步與上述花粉育性情況比較表明,二價(jià)體頻率高的雜種株系,其花粉育性也高,反之則花粉育性低,這為優(yōu)異雜種株系育性評(píng)價(jià)利用提供了細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。
雜種無(wú)性株系真實(shí)性鑒定是馬鈴薯新品種選育的重要環(huán)節(jié),有研究表明不同的SSR 引物在馬鈴薯雜種株系間擴(kuò)增出的指紋特征不同,可分為‘偏母型’、‘偏父型’、‘雜種型’和‘雙親互補(bǔ)型’4種類(lèi)型,其中‘雙親互補(bǔ)型’是鑒定雜種株系與親本的最佳類(lèi)型[17];李長(zhǎng)青等的研究認(rèn)為,在馬鈴薯雜種株系SSR 標(biāo)記雙親互補(bǔ)的基礎(chǔ)上常產(chǎn)生一些缺失或非雙親的新特征帶,可看作是雙親互補(bǔ)型的新類(lèi)型,這可能是在減數(shù)分裂過(guò)程中同源染色體復(fù)制時(shí)部分堿基發(fā)生基因突變或發(fā)生染色體交換和配對(duì)引起的[11,18]。本試驗(yàn)利用篩選出的2對(duì)SSR 特異引物C57和S25對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’雜種F1中選出的20個(gè)優(yōu)良株系基因組DNA 擴(kuò)增的SSR 指紋圖顯示,同一雜種株系用不同SSR 引物擴(kuò)增出的指紋特征不同,不同雜種株系用同一SSR 引物擴(kuò)增出的指紋亦不同,據(jù)此認(rèn)為在馬鈴薯雜種株系鑒定時(shí),除考慮以上雙親互補(bǔ)型、缺失型和新類(lèi)型外,還可以結(jié)合親本及其雜種株系的SSR 指紋差異進(jìn)行判定,若雜種株系與雙親的DNA 指紋明顯不同,即可將其認(rèn)定為真實(shí)的雜種株系,而引起不同雜種株系間的DNA 指紋差異的原因還有待深入研究。另外,本試驗(yàn)中用引物S25可將20個(gè)雜種株系及其與親本完全區(qū)別開(kāi)來(lái),而用引物C57只能區(qū)分90%的雜種株系,因此在建立馬鈴薯雜種株系DNA 指紋圖時(shí)應(yīng)選用2對(duì)以上SSR 特異引物。
花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過(guò)程較為復(fù)雜,受到一系列基因的精準(zhǔn)控制,不論這些基因中的哪一個(gè)發(fā)生倒位、斷裂等變異,均會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂發(fā)生異常,細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生變化,最終導(dǎo)致花粉敗育[19]。不少學(xué)者在水稻[20,21]、玉米[22]、大豆[23]等作物上的研究表明,花粉敗育的主要原因是雜種F1花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí),因染色體組來(lái)自不同親本,在染色體組之間出現(xiàn)不平衡現(xiàn)象,如單價(jià)體、落后染色體和微核等導(dǎo)致雜種不育,因此在減數(shù)分裂時(shí)二價(jià)體出現(xiàn)頻率越高,其花粉育性越高。本試驗(yàn)對(duì)‘MB09’ב隴薯7號(hào)’的8個(gè)優(yōu)異雜種株系花粉母細(xì)胞PMCMⅠ染色體構(gòu)型及其花粉育性觀(guān)測(cè)亦表明,二價(jià)體頻率高的株系其花粉育性亦高,這與前人研究結(jié)果一致,為馬鈴薯雜種株系進(jìn)一步作為雜交中間材料利用提供細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。
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