王 卓，徐碧玉，賈彩紅，李健平，劉菊華，張建斌，苗紅霞，金志強，2＊

（1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所／農(nóng)業(yè)部熱帶生物技術(shù)重點開放實驗室，海口571101；2 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院?？趯嶒炚荆Ｄ鲜∠憬哆z傳改良重點實驗室，?？?70102）

木質(zhì)素是由苯丙烷類單體聚合而成的酚類多聚體，賦予植物機械強度和疏水性，在植物對環(huán)境適應中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)在苔類地錢和紅藻等非維管植物中也存在木質(zhì)素［1］。在植物中木質(zhì)素以三維立體聚合物嵌入植物細胞壁，其木質(zhì)素單體主要分為3類：愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（guaiacyl lignin，G－木質(zhì)素）、對－羥基苯基木質(zhì)素（hydroxy－phenyl lignin，H－木質(zhì)素）和紫丁香基木質(zhì)素（syringyl Lignin，S－木質(zhì)素）。這些單體在不同科的植物中其數(shù)量和比例不同［2－3］。肉桂 醇 脫 氫 酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）屬于依賴于NADPH 的酶類，在木質(zhì)素合成中有著重要作用，是木質(zhì)素單體合成途徑中的還原酶之一。CAD 主要在木質(zhì)素單體合成過程中最后一步起作用，其催化對－香豆酸、松柏醛及芥子酸還原成相應的醇。CAD 在木質(zhì)素種類和功能多樣性中起重要作用［1］。迄今，已從多種植物如煙草［4－5］、桉 樹［6－7］、草 莓［8］、擬 南 芥［9］、苜 蓿［10］、小麥［11］、小 立碗蘚［12］、蒿［13］和 茶［14］等中克 隆了CAD基因。在已完成全基因組測序的香蕉A 基因組中預測出7個CAD 基因［15］。但尚未見香蕉CAD 基因克隆及表達分析的相關(guān)報道。

香蕉是熱帶、亞熱帶發(fā)展中國家重要的農(nóng)作物之一。其果實由于富含蛋白質(zhì)和碳水化合物，是一些熱帶地區(qū)人民的主要糧食和國民收入的主要來源［16］。然而香蕉枯萎病嚴重威脅香蕉的正常生產(chǎn)［17］。木質(zhì)素在植物抗病中起著重要作用，木質(zhì)素快速沉積或木質(zhì)素類物質(zhì)的生成能限制病原菌的生長和侵染，進而起到抗病作用［18－20］。同樣作為木質(zhì)素合成的末端酶，CAD 基因的表達往往也伴隨著病原菌的侵染而增加［21－22］，CAD 基因的表達與植物抗病性密切相關(guān)。因此，了解香蕉CAD 將有助于闡明木質(zhì)素合成的調(diào)控機理，為全面揭示香蕉木質(zhì)素代謝與香蕉枯萎病的密切關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。本研究首次從香蕉中分離并克隆一個MaCAD 基因，利用生物信息學網(wǎng)站分析該基因的結(jié)構(gòu)特性，采用熒光定量技術(shù)分析該基因的表達模式，探討MaCAD在枯萎病菌脅迫下香蕉根系中的表達調(diào)控，有助于進一步了解香蕉抗枯萎病的調(diào)控機理。

1 材料和方法

1．1 材料及處理

供試香蕉品種為‘巴西蕉’（cv．Cavendish）和‘農(nóng)科1號’（cv．Nongke No．1）購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院組培中心，苗齡為移栽大棚后約60d的健康杯苗，其中‘巴西蕉’為枯萎病菌感病品種，‘農(nóng)科1號’為耐病品種。香蕉枯萎病菌4號生理小種［Fusarium oxysporumf specialis（f．Sp）cubense Tropical Race 4，F(xiàn)oc TR4］，為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所張欣博士饋贈。

1．2 方 法

1．2．1 病原菌的培養(yǎng)收集及接種香蕉 將香蕉枯萎病生理4號小種孢子懸浮液接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，28 ℃培養(yǎng)7d，用無菌水將孢子洗下來，用2層Mirocloth膜過濾，濾液4 000r／min離心15min，棄上清，沉淀用50mL無菌水重懸，再4 000r／min離心15min，重復2次，收集Foc TR4孢子。

將‘巴西蕉’（cv．Cavendish AAA）和‘農(nóng)科1號’（cv．Nongke No．1）分為2組，每組60棵幼苗。以蘸根接菌法接種Foc TR4，接種濃度為每毫升1×106個孢子。接種后2、4和6d取樣，以未接種的為對照（0d）。液氮中速凍后，置于－80 ℃冰箱備用，重復3次。

1．2．2 文庫的篩選 取2μL含文庫質(zhì)粒的大腸桿菌DH10B 菌液涂于氯霉素平板上，隨機挑取克隆進 行菌 落PCR 鑒 定，挑 取 大 于800bp 的 克 ?。?3］。使用96孔板進行堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，測序委托北京華大基因技術(shù)公司完成。測出的DNA 序列經(jīng)過切除載體和接頭序列后在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫BLASTn和蛋白數(shù)據(jù)庫BLASTx中進行同源核苷酸和蛋白序列檢索。應用DNAMAN、ProtParam和MEGA4等生物軟件分析獲得cDNA 序列及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點，并與NCBI數(shù)據(jù)庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／blast）和香蕉A 基因 組 數(shù) 據(jù) 庫（http：／／banana－genome．cirad．fr／tools．html）中已知核酸和蛋白序列進行比較分析。

1．2．3 MaCAD1在香蕉不同器官的表達分析 選取生長8個月的香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實按照Wan等［24］的方法提取RNA。每個樣品取4μg總RNA，用Invitrogen SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase合成cDNA 第一鏈。以香蕉根、球莖、假莖、葉、花和果實的cDNA 為模板，以MaActin片段為內(nèi)參，采用RT－PCR 方法對其進行組織特異性表達分析。將MaCAD1在香蕉A 基因組數(shù)據(jù)庫（http：／／banana－genome．cirad．fr／tools．html）中進行比對，在序列5′端非保守區(qū)域設(shè)計MaCAD1基 因 表 達 引 物P1（5′－GAGAAGGGAGAACGGAGTC－3′）和P2（5′－TCCCACCTTGAAGTTGCT－3′）。MaActin1 引 物 為NP1（5′－CGAGGCTCAATCAAA－GA－3′）和NP2（5′－ACCAGCAAGGTCCAAAC－3′）。

1．2．4 香蕉接種Foc TR4后MaCAD1的表達 以接種后不同時間點的香蕉根系cDNA 第一鏈為模板，引物同1．2．3，以MaActin 片段為內(nèi)標，采用實時熒光定量PCR 檢測MaCAD1 的表達。PCR 反應程序為：95 ℃預變性3min；95 ℃變性7s，60 ℃退火15s，72 ℃延伸20s，循環(huán)40 次。實時定量PCR 采用TaRaKa 公司的試劑盒，染料為SYBR Green，在吉泰生物科技公司Mx 3005P 熒光定量PCR 儀上進行。

1．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗組均做3次生物重復，利用SAS軟件（SAS 9．0for Windows）進行顯著性分析。結(jié)果用KyPlot軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 MaCAD1克隆與序列分析

通過對香蕉根系cDNA 文庫克隆的隨機測序，獲得一個可能是香蕉肉桂醇脫氫酶基因的cDNA片段，將克隆測通后獲得完整的ORF（圖1）。測序后經(jīng)BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，該序列與其他植物CAD 基因序列具有較高一致性，表明該序列是香蕉CAD基因編碼框全長cDNA，命名為MaCAD1，GenBank登錄號為KF582533。MaCAD1序列全長為1 427 bp，其中5′非翻譯區(qū)168bp，3′非翻譯區(qū)182bp，含有一個1 077bp 的ORF，編碼358 個氨基酸殘基（圖2）。MaCAD1推導的氨基酸可編碼預期分子量為39．24kD，等電點為6．55。在GenBank 中對MaCAD1蛋白質(zhì)進行保守結(jié)構(gòu)域搜索和同源性分析，結(jié)果表明MaCAD1蛋白屬于CAD1家族成員。MaCAD1蛋白在N 端具有醇脫氧酶的典型保守結(jié)構(gòu)域：包括2個Zn2＋結(jié)合位點和1個NAD（P）輔酶結(jié)合位點（圖3）。為了研究MaCAD1 與其它各物種 間 的 進 化 關(guān) 系，利 用 軟 件 MEGA 4．0 將MaCAD1基因的氨基酸序列和擬南芥、水稻的CAD 氨基酸序列利用軟件MEGA 4．0中的N－J的方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖4結(jié)果可知，所有CAD基因大致可以分為3 個類型。MaCAD1 分屬于ClassⅢ類，它與OsCAD6同源關(guān)系最近（圖4）。

2．2 香蕉MaCAD1組織特異性表達分析

采用半定量RT－PCR方法，以MaActin作為內(nèi)參，分別檢測香蕉不同部位MaCAD1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，MaCAD1在假莖中表達量最高，是根中的6．2倍。在葉和果實中表達量較高，其表達量分別是根系中相對表達量的3．2和2．6倍（圖5）。

圖1 MaCAD1的全長cDNA PCR 產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果A．文庫質(zhì)?？寺z測；B．MaCAD1ORF擴增；M．DL2000Fig．1 Identification of the PCR products of full－length cDNA sequence of MaCAD1 A．Plasmid cloning PCR product；B．MaCAD1 ORF PCR product；M．DL2000

圖2 MaCAD1編碼的核酸和氨基酸序列帶下劃線的堿基序列表示起始密碼子；＊表示終止密碼子Fig．2 Nucleotide and deduce amino acid sequence of MaCAD1 The nucleotide sequence with underlined means initiator codon；＊ means terminator codon

2．3 不同抗性香蕉品種接種FocTR4后MaCAD1的表達

香蕉枯萎病是一種典型的土傳病害，病菌從香蕉根系入侵，形成整株危害，在香蕉整個生長周期均可發(fā)病。接種3周后，感病品種‘巴西蕉’葉片明顯發(fā)黃、下垂，葉片周圍干枯，植株生長明顯減緩；耐病品種‘農(nóng)科1號’則沒有明顯的發(fā)病癥狀（圖6）。

在感病品種‘巴西蕉’中，MaCAD1的相對表達量在接種FocTR4后逐漸下降，且差異達到極顯著（P＜0．01）；在接種6d時MaCAD1的相對表達量達到最低，相對表達量值為0．29，僅為對照的三分之一（圖7）。在耐病品種‘農(nóng)科1 號’中MaCAD1的相對表達量在接種FocTR4 后顯著增加（P＜0．01），在接種6d時MaCAD1的相對表達量達到最大，是對照的4．1倍（圖7）。因此，從相對表達量的變化上看MaCAD1在感病品種‘巴西蕉’中的表達被抑制，而在耐病品種‘農(nóng)科1號’中的表達被激活，表明該基因可能與香蕉的抗病反應密切相關(guān)。

3 討 論

圖3 MaCAD1和其他植物CAD 的序列比對分析圖中從上至下依次代表的是棗椰、油棕、中國蓮、木本棉、梅、甜菜、茶、煙草、蘋果中相應的CAD氨基酸序列；劃實線部分為Zn2＋結(jié)合位點，虛線部分為NADPH 結(jié)合位點Fig．3 Alignment of amino acid sequences of MaCAD1and other plant CADs The amino acid sequences in the maps which from the top to the bottom represent are：Phoenix dactylifera，Elaeis guineensis，Nelumbo nucifera，Gossypium arboreum，Prunus mume，Beta vulgaris subsp．vulgaris，Camellia sinensis，Nicotiana tomentosiformis，Malus domestica．Zn2＋binding motifs are underlined，and NADPH binding motif is dash underlined

圖4 MaCAD1蛋白與擬南芥和水稻CAD 蛋白的進化樹圖中分支點的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節(jié)點可信度的百分比；括號內(nèi)為氨基酸登錄號Fig．4 Phylogenetic relationship between the banana of CAD1and CAD proteins fromArabidopsis thaliana and Oryza sativa The number on the branches indicate the reliability percent of Bootstrap values based on 1 000replications；The accession No．was given in brackets

圖5 QRT－PCR檢測MaCAD1在香蕉不同部位中的表達情況R．根；Rh．球莖；P．假莖；L．葉；F．花；Fr．果實Fig．5 Quantitative RT－PCR analysis of the expression MaCAD1in banana tissues R．Root；Rh．Rhizome；P．Psedostem；L．Leaf；F．Flower；Fr．Fruit

圖6 耐病品種‘農(nóng)科1號’（A）與感病品種‘巴西蕉’（B）接種Foc TR4后的癥狀Fig．6 Symptoms of resistant（A）and susceptible（B）varieties after inoculation Foc TR4

圖7 不同抗性香蕉品種接種FocTR4后MaCAD1的表達＊＊代表接種前后差異達到0．01水平Fig．7 The expression of MaCAD1in banana varieties with different resistance after inoculation with FocTR4＊＊refers to significant difference after inoculation at 0．01level

木質(zhì)素經(jīng)苯丙烷生物合成途徑合成，是植物中主要的代謝產(chǎn)物之一，其含量僅次于纖維素的大分子有機物質(zhì)，在為植物提供機械力、運輸水分和抵抗外界逆境等方面起著重要作用［25－26］。CAD為催化木質(zhì)素單體生物合成的最后一個酶，在木質(zhì)素種類和功能多樣性中起著重要作用［1］。本研究獲得1個全長香蕉CAD1基因。在序列分析方面，該基因與其它植物的CAD 基因具有較高一致性。MaCAD1編碼氨基酸的分子量為39．24kD，等電點為6．55，這與已報道的其它植物CAD 蛋白特征相似［3，21］。MaCAD1推導氨基酸序列中包含完整的醇脫氧酶的典型保守結(jié)構(gòu)域，包括2 個Zn2＋結(jié)合位點和1 個NAD（P）輔酶結(jié)合位點，因此MaCAD1為含Zn2＋醇脫氫 酶［8－9］；同 時，NAD（P）輔 酶 結(jié) 合 位 點 也 表 明MaCAD1屬于 典 型 的 植 物CAD 酶 類［4，7－8］。聚 類 分析結(jié)果表明MaCAD1與水稻OsCAD6親緣關(guān)系較近，同屬于ClassⅢ。在其它植物中，Ⅲ類CAD 編碼的酶不僅能與松柏醛、香豆醛、芥子醛等催化底物特異結(jié)合，同樣還能與脂肪醛、肉桂酰等物質(zhì)結(jié)合生成不同類型的木質(zhì)素［6］。這些結(jié)果均表明MaCAD1基因編碼的確實為香蕉Ⅲ類CAD 蛋白，可能在香蕉木質(zhì)素合成中起作用。

在其他植物中，CAD 基因在根、莖、葉和花等組織中均有表達［27］。本研究在根、球莖、假莖、葉、花和果實中均檢測到MaCAD1 表達，表明MaCAD1 在香蕉組織中屬于組成型表達，根據(jù)這一結(jié)果推出該基因可能在香蕉的生長和發(fā)育過程中起著重要作用。在植物與病原菌互作時，木質(zhì)素的含量、類型和積累速度在不同植物與病原菌互作時存在差異［28］。栓皮 櫟（Quercus variabilis Bl．）的QsCAD1 在 抗Phytophthora cinnamomi的過程中能失活該菌產(chǎn)生的毒素［22］。在香蕉與枯萎病菌互作時，抗病品種比感病品種能積累更多的木質(zhì)素，CAD 活性和木質(zhì)素的生物合及香蕉抗枯萎病能力成密切相關(guān)［29］。MaCAD1在感病品種‘巴西蕉’（cv．Cavendish）中的基因表達被抑制，而在耐病品種‘農(nóng)科1 號’（cv．Nongke No．1）中被激活，MaCAD1基因表達與香蕉抗病性正相關(guān)，說明該基因可能參與香蕉響應Foc TR4侵染的過程。目前，香蕉抗病種質(zhì)的創(chuàng)制是解決香蕉枯萎病的有效方法之一，然而缺乏有效的抗病種質(zhì)的鑒定及篩選方法。利用標記基因在苗期篩選抗病苗能節(jié)約育種時間及效率。MaCAD1 在耐病品種中表達趨勢與感病品種相反且相對表達量的倍數(shù)高于感病品種，因此該基因可以當作一個新的抗枯萎病菌侵染的標記基因。

本試驗克隆了MaCAD1基因，并對其序列進行生物信息學分析，對其組織和接種Foc TR4的響應研究說明該基因參與了香蕉的生長發(fā)育及抗病反應。今后將繼續(xù)對該基因在香蕉抗枯萎中的作用機制進行進一步的研究，以期能揭示CAD 在香蕉抗枯萎病中的生理作用。

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