程茁，丁偉，王懷彪

復(fù)合微生物對(duì)水稻立枯病抑菌作用及田間應(yīng)用效果研究

程茁1，丁偉2，王懷彪2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱150030）

復(fù)合微生物NEB應(yīng)用對(duì)解決水稻旱育秧田化學(xué)農(nóng)藥和工業(yè)濃硫酸大量應(yīng)用產(chǎn)生的環(huán)境安全問(wèn)題具有重要作用。文章采用室內(nèi)抑菌和田間大棚育苗相結(jié)合的方法，研究復(fù)合微生物NEB對(duì)水稻立枯病抑菌作用和田間防治效果。從立枯病發(fā)病水稻根際土壤中分離得到立枯病病原菌尖孢鐮孢菌（F.oxysporum），NEB對(duì)該病原菌具有顯著抑菌效果。三年三個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)田間應(yīng)用表明，NEB應(yīng)用后，僅在2014年綏化試驗(yàn)點(diǎn)水稻幼苗立枯病發(fā)病率為30%，與化學(xué)壯秧劑50%的發(fā)病率相比，立枯病發(fā)病率顯著降低，NEB對(duì)水稻立枯病具有顯著防治效果。

復(fù)合微生物；水稻；立枯病；抑菌作用

程茁,丁偉,王懷彪.復(fù)合微生物對(duì)水稻立枯病抑菌作用及田間應(yīng)用效果研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(7)∶22-27.

Cheng Zhuo,Ding Wei,Wang Huaibiao.Study on bacteriostasis of compound microorganism preparation on rice blight pathogen and its application in fieldl[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶22-27.(in Chinese with English abstract)

Study on bacteriostasis of compound microorganism preparation on rice blight pathogen and its application in field

水稻是中國(guó)重要糧食作物，水稻旱育稀植技術(shù)自20世紀(jì)80年代引進(jìn)到吉林和黑龍江以來(lái)，已在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行大面積推廣應(yīng)用[1-3]，該技術(shù)對(duì)大幅度提高寒地水稻產(chǎn)量和品質(zhì)發(fā)揮了重要作用。旱育壯秧技術(shù)是水稻旱育稀植技術(shù)重要內(nèi)容之一，包括土壤調(diào)酸、消毒、施肥和水分溫度管理。20世紀(jì)90年代初期，科研工作者把秧田旱育壯秧關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行集成和優(yōu)化，使水稻壯秧劑得以大面積應(yīng)用。但水稻壯秧劑中的化學(xué)殺菌劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和工業(yè)濃硫酸會(huì)影響環(huán)境安全。利用具有殺菌活性微生物、產(chǎn)酸微生物與化學(xué)肥料結(jié)合，研制水稻秧田生物藥肥制劑是解決目前水稻壯秧劑影響環(huán)境安全問(wèn)題的有效方法。水稻旱育壯秧技術(shù)難點(diǎn)是立枯病防治和秧苗養(yǎng)分需求滿足問(wèn)題。本文研究蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、放線菌（Actinomy?cete）和產(chǎn)酸菌等微生物復(fù)合菌劑對(duì)水稻立枯病菌抑菌作用，及其復(fù)合菌劑與N、P、K復(fù)配而成的復(fù)合微生物藥肥在田間對(duì)水稻秧苗立枯病的防治效果，以期為利用微生物開發(fā)環(huán)境友好型水稻壯秧劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為龍粳29號(hào)，NEB復(fù)合微生物由蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、放線菌（Actinomycete）和產(chǎn)酸菌復(fù)配而成，各菌種均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系提供，化學(xué)壯秧劑在市場(chǎng)上購(gòu)買。

1.2 設(shè)計(jì)

室內(nèi)試驗(yàn)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，從水稻立枯病發(fā)病植株根際土壤中分離并鑒定立枯病病原菌，采用抑菌圈法，分別對(duì)NEB復(fù)合菌及其單個(gè)菌株對(duì)立枯病病原菌的抑菌效果進(jìn)行測(cè)定。

田間試驗(yàn)于2012～2014年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)田、阿城區(qū)和綏化市北林區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)大棚內(nèi)進(jìn)行，4月5日～4月10日播種。田間試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理（見表1），水稻苗床小區(qū)面積為10 m2,3次重復(fù)。田間試驗(yàn)采用機(jī)插盤育秧方法，秧盤規(guī)格為30 cm× 60 cm，播種前分別將供試的NEB復(fù)合生物菌及化學(xué)肥料復(fù)配成復(fù)合微生物藥肥，用化學(xué)壯秧劑作對(duì)照，按設(shè)計(jì)用量與過(guò)篩旱田土混合均勻，每盤裝3 kg并澆透底水，每盤播種催芽種子125 g后，再用上述混合土壤1.0 kg均勻覆蓋。

表1 處理及藥肥用量Table 1Treatments and use rate of pesti-fertilizer

1.3 方法

1.3.1 水稻立枯病病原菌分離和鑒定

采用稀釋涂布平板法，稱取10 g立枯病發(fā)病水稻根際土樣，放入200 mL三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌水，搖床震蕩25 min，靜止30 min，吸取1 mL土壤懸浮液，加入9 mL去離子水，在試管中充分搖勻，將土壤懸浮液逐級(jí)稀釋至106倍，利用顯微鏡觀察孢子數(shù)為10～40個(gè)的菌懸液，將0.1 mL菌懸液均勻涂布在PDA培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)。依據(jù)菌落形態(tài)特征對(duì)立枯病病原菌進(jìn)行初步鏡檢，把初步鑒定的病原菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

凹玻片和培養(yǎng)皿滅菌后，將凹玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，取45℃100 μL SNA培養(yǎng)基置于凹玻片凹下處，室溫下冷卻。用挑針在培養(yǎng)5 d后的PDA平板上挑取少量菌絲于SNA培養(yǎng)基內(nèi)，蓋上蓋玻片，25℃下培養(yǎng)3 d。3 d后在顯微鏡下觀察大、小分生孢子和厚垣孢子，參照王拱辰方法進(jìn)行形態(tài)鑒定[4]。

將單孢分離出來(lái)的病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，菌株培養(yǎng)液送上海生物工程公司進(jìn)行18S rDNA鑒定。

1.3.2 NEB復(fù)合菌對(duì)立枯病病原菌的抑菌作用

采用濾紙片法，用打孔器將定性濾紙打成直徑為0.5 cm圓片，120℃高溫滅菌30 min。向滅菌后培養(yǎng)皿中倒入適量（約4 mm厚）已滅菌PDA培養(yǎng)基，取1 mL濃度為108cfu·mL-1立枯病病原菌菌懸液滴入培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基與菌液混合均勻，靜置凝成平板。將放線菌、枯草芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌和NEB復(fù)合菌懸浮液分別稀釋到0、101、102、104、106、108、1010cfu·mL-1，用滅菌濾紙粘取各濃度菌懸液，并放在接種立枯病病菌平板中距離中心等距離的三點(diǎn)，用鑷子稍用力按一下，使之與培養(yǎng)基充分緊貼，每個(gè)濃度5次重復(fù)，用滅菌水浸濕的濾紙片作空白對(duì)照。在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃下培養(yǎng)并觀察，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.3 NEB復(fù)合生物制劑對(duì)水稻立枯病防治效果的田間調(diào)查

2012～2014年，在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)、阿城區(qū)和綏化市北林區(qū)試驗(yàn)點(diǎn)，對(duì)每個(gè)處理的育苗棚內(nèi)水稻立枯病發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)3次重復(fù)。立枯病發(fā)病率按以下公式進(jìn)行計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，利用DPS 10.15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行5%差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻立枯病病原菌分離和鑒定

2.1.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

分離、提純、篩選出的三種菌株分別命名為IS133、IS134、IS135，三種菌株形態(tài)上基本相近，菌落生長(zhǎng)迅速。25℃條件下，PDA培養(yǎng)基上測(cè)定菌落直徑為43～52 mm，7 d菌落直徑為70～93 mm。氣生菌絲表現(xiàn)為羊毛絮狀，開始為白色，后變?yōu)榉凵磷仙趁娉．a(chǎn)生藍(lán)紫色色素，菌株之間形態(tài)差異不大；小型分生孢子會(huì)產(chǎn)生大量假頭生分生孢子，形狀為橢圓形或腎形，0～1隔，鏡檢結(jié)果為（6～14）μm×（3～2.8）μm；分生孢子座容易產(chǎn)生粘狀的分生孢子座；大型分生孢子是美麗型，細(xì)胞壁比較薄，細(xì)胞壁向兩邊均勻地逐漸變窄，大多為2～6隔，多數(shù)是3隔，鏡檢結(jié)果為（22～51）μm×（4～5）μm，沒(méi)有觀察到厚垣孢子（見圖1）。這三種菌株類似尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）。

圖1 立枯病病原菌孢子形態(tài)特征Fig.1Spore characters of blight pathogen(F.oxysporum)

2.1.2 立枯病病原菌分子生物學(xué)鑒定

18S rDNA法對(duì)菌株IS133、IS134、IS135進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物DNA條帶大小為520～540 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰可見（見圖2）。

圖2 三種病原菌株18S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2PCR results of 18S rDNA suquence of three kinds of pathogens bacterial strains

把菌株基因序列結(jié)果提交至GenBank，進(jìn)行相似度比對(duì)，結(jié)果顯示菌株IS133堿基對(duì)數(shù)為535 bp，與尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）相似度為100%（見圖3）。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)共同鑒定，證明該菌株為尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）。

2.2 NEB及其單菌株對(duì)立枯病病原菌抑菌效果

蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、放線菌（Actinomycete）和NEB復(fù)合菌在不同濃度（101、102、104、106、108、1010cfu·mL-1）下，對(duì)濃度為108cfu·mL-1的IS133病原菌均產(chǎn)生明顯抑菌帶，其中單個(gè)菌種中，蠟質(zhì)芽孢桿菌菌落直徑最大，枯草芽孢桿菌菌落直徑相對(duì)最??；復(fù)合菌NEB菌落生長(zhǎng)直徑大于單一菌株生長(zhǎng)直徑，表明NEB對(duì)病原菌IS133抑制效果最強(qiáng)。通過(guò)對(duì)不同濃度下單菌株和復(fù)合菌NEB菌落在含IS133立枯病病原菌培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)比較可見，當(dāng)NEB接種濃度在60 cfu·mL-1下時(shí)，其菌落生長(zhǎng)直徑最大，表明該濃度是復(fù)合菌NEB最適抑菌濃度（見表2）。

圖3 被測(cè)菌株IS133堿基序列與NCBI上收錄的Fusarium oxysporum 18S rDNA序列之間對(duì)比結(jié)果Fig.3Comparison result between the base sequence of determined isolate IS133 and 18S rDNA sequence of Fusarium oxysporum included in NCBI

表2 NEB及其單菌株不同濃度對(duì)IS133的抑菌效果Table 2Inhibition effects of NEB and its single bacterial strain to IS133

2.3 NEB復(fù)合微生物對(duì)水稻立枯病田間防治效果

對(duì)不同試驗(yàn)點(diǎn)水稻苗期立枯病發(fā)病率調(diào)查結(jié)果（見表3）表明，2012年阿城試驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)用化學(xué)壯秧劑和只應(yīng)用化學(xué)肥料處理的水稻立枯病發(fā)病率分別為20%和50%，綏化試驗(yàn)點(diǎn)發(fā)病率為50%和55%，NEB復(fù)合微生物藥肥制劑立枯病發(fā)病率為0； 2013年各試驗(yàn)點(diǎn)水稻苗床幼苗均未發(fā)生立枯??；2014年綏化試驗(yàn)點(diǎn)各處理均有立枯病發(fā)生，但NEB復(fù)合微生物制劑應(yīng)用后水稻幼苗立枯病發(fā)病率為30%，與化學(xué)壯秧劑和只應(yīng)用肥料相比，立枯病發(fā)病率顯著降低。田間試驗(yàn)進(jìn)一步證明NEB復(fù)合微生物對(duì)水稻立枯病具有較好防治效果。

表3 NEB復(fù)合微生物對(duì)不同試驗(yàn)點(diǎn)水稻苗期立枯病發(fā)病率的影響Table 3Effect of NEB on rice seedling blight ratio in different experiment fields(%)

3 討論

土壤中多種病原菌均可造成水稻發(fā)生苗期立枯病，包括腐霉菌（Pythium spp.）、鐮孢菌（Fusari?um spp.）、根霉菌（Rhizopus spp.）均能引起秧苗在2～5葉期內(nèi)發(fā)生立枯病[5-7]；長(zhǎng)蠕孢屬（Helminthospo?rium spp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）某些種也可導(dǎo)致水稻秧苗干枯、腐敗和幼苗扭曲[8-10]；高同春等認(rèn)為水稻秧苗立枯病致病的鐮刀菌主要是串珠鐮刀菌（F.moniliforme）[11]。鄭雯等從黑龍江6個(gè)不同地區(qū)采集帶病水稻秧苗，經(jīng)人工分離后獲得6個(gè)優(yōu)勢(shì)種中5個(gè)為鐮孢菌，回接水稻立枯病發(fā)病率較高的是禾谷鐮孢菌（F.graminearum）和尖孢鐮孢菌（F.oxysporum）[12]。本文從發(fā)病水稻根際土壤中分離并鑒定尖孢鐮孢菌，是目前黑龍江省已知水稻立枯病致病菌之一。因此，利用該病原菌驗(yàn)證NEB復(fù)合微生物及其構(gòu)成NEB的單一菌株抑菌作用可行，室內(nèi)研究結(jié)果證實(shí)NEB復(fù)合微生物對(duì)立枯病病原菌具有良好的抑菌效果，為NEB進(jìn)一步在水稻育苗生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

水稻苗床立枯病防治主要以預(yù)防為主，治療為輔。立枯病預(yù)防關(guān)鍵措施是提高水稻秧苗抗病性。通過(guò)種子清選和消毒、土壤消毒和調(diào)酸、營(yíng)養(yǎng)元素合理搭配施用及苗床早期溫度和水分管理實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻苗期立枯病的有效預(yù)防。NEB復(fù)合微生物制劑由放線菌（Actinomycete）、枯草芽孢桿菌（Bacil?lus subtilis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）和產(chǎn)酸菌復(fù)配而成，自從Johnson等從枯草芽孢桿菌中分離、鑒定出抗真菌肽后[13]，枯草芽孢桿菌作為生防菌被廣泛研究和應(yīng)用[14]。蠟質(zhì)芽孢桿菌具有極強(qiáng)抗逆性和抗菌能力，在抑制立枯絲核菌菌絲生長(zhǎng)的同時(shí)可激發(fā)水稻對(duì)立枯絲核菌抗性[15]。放線菌可產(chǎn)生真菌胞璧水解酶，使病原真菌細(xì)胞壁溶解，對(duì)致病微生物具有良好抑制作用[16]。利用NEB復(fù)合微生物與無(wú)機(jī)N、P、K等營(yíng)養(yǎng)元素復(fù)配成水稻秧田生物藥肥，既可利用微生物抑菌和產(chǎn)酸功能，又可為水稻苗期生長(zhǎng)提供充足養(yǎng)分。本文通過(guò)三年三地研究認(rèn)為，NEB復(fù)合微生物與化學(xué)肥料復(fù)配應(yīng)用于水稻旱育苗生產(chǎn)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)苗期立枯病的有效預(yù)防。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)分離并鑒定水稻立枯病病原菌，命名為IS133，NEB復(fù)合微生物對(duì)該病原菌具有顯著抑菌作用。田間應(yīng)用NEB復(fù)合微生物藥肥對(duì)水稻旱育秧田秧苗立枯病發(fā)生具有明顯防治效果。

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CHENG Zhuo1,DING Wei2,WANG Huaibiao2(1.School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University, Harbin 150030,China∶2.School ofAgriculture,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

Application of NEB with a kind of compound microorganism preparation had the important action on solving chemical pesticide and concentrated sulfuric acid used in dry land rice seedling culture. Bacteriostasis of NEB in laboratory and field experiments was conducted in this paper to study the effects of NEB on rice seedling blight pathogen inhibition and rice seedling blight management in greenhouse.Blight pathogen namedF.oxysporumwas separated from rhizosphere soil collected from blight infected rice seedlings,and it was used in this experiments which showed that NEB significantly inhibited the growth of the blight pathogen.Three field sites within three years experiments showed that only in Suihua experiment site rice blight seedling ratio(RBSR)was 30%in the year of 2014,and the ratio was significantly decreased compared with chemical seedling strengthening agent with 50%RBSR in control field.NEB had obvious effects on rice seedling blight management.

compound microorganism preparation;rice;blight pathogen;bacteriostasis

S511；S435.621.2+1

A

1005-9369（2015）07-0022-06

時(shí)間2015-7-9 14:42:50[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.013.html

2015-01-15

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目資助（GC12B103）

程茁（1970-），女，實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)藥作用機(jī)理。E-mail:dingchengzhuo@126.com