周賀，馬海艷，趙睿，江振華，林忠喬，錢聰，李雅娟*

二倍體泥鰍×四倍體泥鰍F1不同發(fā)育階段染色體核型分析

周賀1，馬海艷1，趙睿2，江振華1，林忠喬1，錢聰1，李雅娟1*

（1.大連海洋大學，農業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.北京市水產技術推廣站，北京101105）

以中國長江流域天然四倍體泥鰍為父本，大連農貿市場二倍體泥鰍為母本，通過倍間雜交獲得雜交三倍體泥鰍，對早期胚胎、6月齡及12月齡染色體核型進行初步分析。結果表明，早期胚胎整3倍體染色體數目為3n=75，核型為16M+7SM+52T，NF=98，亞三倍體染色體數目為3n=73，核型為15M+6SM+52T，NF=94，超三倍體染色體數目為3n=76，核型為16M+6SM+54T，NF=98；6月齡整三倍體染色體數目為3n=75，核型為15M+6SM+ 54T，NF=96，亞三倍體染色體數目為3n=72，核型為15M+6SM+51T，NF=93，超三倍體染色體數目為3n=77，核型為15M+6SM+56T，NF=98；12月齡整三倍體染色體數目為3n=75，核型為12M+8SM+55T，NF=95；亞三倍體染色體數目為3n=71，核型為16M+6SM+49T，NF=93，超三倍體染色體數目為3n=76，核型為18M+8SM+50T，NF= 102。結果表明，二倍體泥鰍×四倍體泥鰍雜交后代是含有三套染色體組的三倍體，不同發(fā)育階段整三倍體染色體數目相同，均為3n=75，但染色體核型表現多態(tài)性。非整倍體（超三倍和亞三倍）中增加和缺少的染色體數目及類型無規(guī)律可循。

二倍體泥鰍；四倍體泥鰍；F1；不同發(fā)育階段；染色體核型

三倍體魚類以其可育性差、生長速度快及抗病力強等特性而成為魚類遺傳育種研究熱點。四倍體和二倍體雜交理論上可獲得100%三倍體。雜交獲得三倍體與人工誘導方法相比，避免了繁瑣的人工處理程序及理化誘導手段可能對受精卵造成的傷害，提高三倍體孵化率，不會對生態(tài)造成外來物種污染，具有良好應用前景。利用天然四倍體與二倍體雜交制備新型雜交三倍體是解決某些魚類三倍體產業(yè)化的難點。

泥鰍存在自然多倍體現象，在日本市場發(fā)現起源不明的四倍體泥鰍，但未發(fā)現天然四倍體[1-3]。中國長江流域存在大量天然四倍體泥鰍[4-6]。Li等證實我國天然四倍體泥鰍是含四套染色體組遺傳四倍體（4n=100）、雌雄均能產生正常的2n配子[7-9]。本研究室利用天然四倍體泥鰍與二倍體雜交制備一種新型雜交三倍體，利用混合胚胎制備染色體標本，對不同倍性泥鰍雜交后代染色體數目組成進行研究，結果表明，正、反雜交三倍體泥鰍均含非整倍體（染色體數目3n＜75或3n＞75）[10]。Zhao等報道超三倍及超四倍泥鰍存在[11]。但關于非整倍體產生原因及不同發(fā)育階段染色體核型有無變化目前尚不清楚。因此，本研究以長江流域天然四倍體泥鰍為父本，大連農貿市場二倍體泥鰍為母本，通過倍間雜交獲得雜交三倍體泥鰍為研究對象，采用低滲-空氣干燥法制片，制備單個胚胎和鰓細胞染色體標本，對早期胚胎、6月齡及12月齡染色體核型進行分析。旨在了解二倍體×四倍體F1不同發(fā)育階段染色體行為，為雜交三倍體泥鰍染色體組穩(wěn)定性提供細胞學證據。

1 材料與方法

1.1 親魚采集

天然四倍體泥鰍（4n=100）來自湖北省赤壁市（雌2尾，雄2尾），二倍體泥鰍（2n=50）來自大連農貿市場（雌2尾，雄2尾）。實驗室水族箱暫養(yǎng)，暫養(yǎng)溫度為（22±1）℃。體長為11.4～18.6 cm，體重10.15～63.13 g。

1.2 人工催產及授精

天然四倍體泥鰍與大連農貿市場二倍體泥鰍進行1∶1雜交，人工催產，干法受精，配制2n♀× 4n♂雜交組合。

1.3 幼魚培育

孵化和幼魚培育溫度為（25±1）℃。經常更換曝氣的水，保持室內空氣新鮮和流通。及時用吸管吸出死亡胚胎。

1.4 染色體標本制備

1.4.1 早期胚胎染色體標本制備

分別取發(fā)育眼胞期單個胚胎30～50個，用鑷子去卵膜和卵黃放入盛有0.0025%秋水仙素中處理45 min，0.8%檸檬酸鈉低滲20 min，卡諾固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，冷凍過夜。冷滴片，Olympus AH2油鏡下拍照。

1.4.2 鰓細胞染色體標本制備

采用稍加修改的PHA體內二次注射法[12]和快速制備魚類染色體方法[13]制備鰓細胞染色體標本，即將每尾魚活體腹腔注射PHA溶液，劑量為6 μg·g-1（魚體質量），18～20 h后第2次注射同樣劑量PHA，繼續(xù)作用4～6 h后活體腹腔注射體積分數為0.1%秋水仙素溶液，劑量為6 μg·g-1（魚體質量），再次作用2～3 h后，解剖取鰓。將取下來的鰓樣本用體積分數為0.8%檸檬酸鈉溶液2～3 mL在室溫下低滲45 min，再用卡諾固定液固定3次，每次15 min，采用空氣干燥法制備染色體標本，然后用體積分數為10%Giemsa染液染色2 h，自來水沖洗干凈后自然風干，顯微鏡下鏡檢染色體并拍照。

1.5 核型分析

選染色體分散良好，無重疊的完整中期分裂相5個，測量染色體絕對長度及長臂與短臂長度，計算每條染色體平均相對長度和臂比。核型分析參照Levan等標準進行[14]。染色體長臂和短臂比值在1.0～1.7的為中部著絲粒染色體（M），1.7～3.0的為亞中部著絲粒染色體（SM），3.0～7.0的為亞端部著絲粒染色體（ST），7以上的為端部著絲粒染色體（T）。

2 結果與分析

2.1 早期胚胎染色體核型分析

雜交三倍體泥鰍早期胚胎染色體整三倍體的染色體數目為3n=75，其核型公式為16M+7SM+ 52T，臂數NF=98，增加4條亞中部著絲點染色體、缺少4條端部著絲點染色體（見圖1A）；亞三倍體染色體數目為3n=73，核型公式為15M+6 SM+ 52T，臂數NF=94，缺少2條端部著絲點染色體（見圖1B）；超三倍體的染色體數目為3n=76，核型公式為16M+6SM+54T，臂數NF=98，增加1條中部著絲點染色體（見圖1C）。

圖1 雜交三倍體泥鰍早期胚胎染色體中期分裂相及核型Fig.1Metaphase cells of early embryo chromosome and karyotypes of original mated

2.26 月齡染色體核型分析

6月齡雜交三倍體泥鰍整三倍體染色體數目為3n=75，其核型公式為15M+6SM+54T，臂數NF=96（見圖2A）；亞三倍體染色體數目為3n=72，核型公式為15M+6SM+51T，臂數NF=93，缺少3條端部著絲點染色體（見圖2B）；超三倍體染色體數目為3n= 77，核型公式為15M+6SM+56T，臂數NF=98，增加2條端部著絲點染色體（見圖2C）。

2.312 月齡染色體核型分析

12月齡雜交三倍體泥鰍整三倍體染色體數目為3n=75，其核型公式為12M+8SM+55T，臂數NF=95，缺少3條中部著絲點染色體，增加2條亞中部著絲點染色體，增加1條端部著絲點染色體（見圖3A）；亞三倍體染色體數目為3n=71，核型公式為16M+6SM+49T，臂數NF=93，增加1條中部著絲點染色體，缺少5條端部著絲點染色體（見圖3B）；超三倍體染色體數目為3n=76，核型公式為18M+8SM+50T，臂數NF=102，增加3條中部著絲點染色體，增加2條亞中部著絲點染色體，缺少4條端部著絲點染色體（見圖3C）。

圖26 月齡雜交三倍體泥鰍染色體中期分裂相及核型Fig.2Metaphase cells of six month age chromosome and karyotypes of original mated

圖312 月齡雜交三倍體泥鰍染色體中期分裂相及核型Fig.3Metaphase cells of twelve month age chromosome and karyotypes of original mated

4 討論與結論

非整倍體是染色體數目變異的一種類型，非整倍體生物是指染色體組中增添或減少個別染色體的生物。在動物中，非整倍體常致死或引起發(fā)育障礙[15-16]。貝類是低等動物，能夠耐受某些非整倍體存在，Wang等研究結果表明，在多種貝類中非整倍體可存活，在太平洋牡蠣中至少已發(fā)現12種類型的非整倍體可存活，能正常生長，并表現出優(yōu)勢[17-18]；在合浦珠母貝也發(fā)現有5種非整倍體存活[19]；在皺紋盤鮑中也發(fā)現非整倍體個體[20]。Li等報道二倍體泥鰍與天然四倍體泥鰍雜交，正、反交（2n×4n，4n×2n）后代均出現大量能存活的非整三倍體個體（3n＞75或3n＜75），說明利用天然四倍體泥鰍和二倍體泥鰍雜交制備雜交三倍體在養(yǎng)殖生產上具有推廣價值[10]，這與Zhang等報道超三倍體泥鰍能存活結果[16]一致。本研究對二倍體×四倍體F1不同發(fā)育階段染色體核型分析結果表明，早期胚胎、6月齡及12月齡整三倍體染色體數目均為75，但在染色體核型上存在差異，表現為端部、亞中部、中部染色體缺少或增加。早期胚胎、6月齡及12月齡非整倍體泥鰍染色體數目及核型均表現差異。總之，不僅出現大量非整倍體染色體數目，核型發(fā)生隨機變化，缺少和增加染色體無規(guī)律可循。

非整倍體產生原因是在細胞減數分裂時偶然發(fā)生染色體不配對、不分離、分離延遲等，形成比正常配子（n）多一條染色體的配子（n+1）和比正常少一條染色體的配子（n-1）。這些配子與正常配子結合或相互結合時，形成各種非整倍體。二倍體與四倍體雜交產生非整三倍體的原因，Guo等在研究太平洋牡礪四倍體性腺發(fā)育和減數分裂后，認為四倍體后代中非整倍體數量增加是因為減數分裂中同源染色體不完全配對形成單價體和三價體所致[21]。姜波等在二倍體與四倍體雜交產生三倍體牡蠣群體中檢測到非整倍體，認為非整倍體產生是由于四倍體父本在精子發(fā)生過程中減數分裂發(fā)生失誤，形成三價體或單價體，產生非整倍體的精子所致[22]。Allen等認為三倍體基因組不穩(wěn)定，其原因可能是三倍體逐漸失去1套染色體組，形成嵌合體，進一步還原為二倍體[23]。Li等對我國天然四倍體泥鰍雌、雄生殖細胞染色體減數分裂行為進行研究，發(fā)現我國天然四倍體泥鰍中無論雌、雄均由0～6個四價染色體和38～50個二價染色體組成[8]。四價體的存在為天然四倍體泥鰍產生非整倍體配子提供細胞遺傳學證據。因此，這些非整倍體產生的原因可能是四倍體父母本在減數分裂過程中，四價染色體不均衡分離而產生非整倍體配子所致。

本研究結果表明，二倍體泥鰍×四倍體泥鰍雜交后代含三套染色體組的三倍體。不同發(fā)育階段整三倍體染色體數目相同，均為3n=75，但染色體核型表現多態(tài)性。非整倍體（超三倍體和亞三倍體）中增加和缺少的染色體數目及類型無規(guī)律可循。本試驗結果可為雜交三倍體泥鰍染色體組穩(wěn)定性提供細胞學證據，為我國三倍體魚類產業(yè)化探索高效易行新途徑提供理論參考。

[1]Arai K,Matsubara K,Suzuki R.Karyotyoe and erythrocyte size of spontaneous tetraploidy in the loach,Misgurnus anguillicaudatus [J].Nippon Suisan Gakkaishi,1991,57:2167-2172.

[2]Zhang Q,Arai K,Yamashita M,Cytogenetic mechanisms for trip?loid and haploid egg formation in the triploid loach Misgurnus an?guillicaudatus[J].Exp Zool,1998,281:608-619.

[3]Morishima K,Nakamura Y,Etsuko Bando S,et al.Cryptic clonal lineages and genetic diversity in the loachMisgurnus anguillicau?datus(Teleostei:Cobitidae)inferredfromnuclear and mitochondri?al DNA analyses[J].Genetica,2008,132:159-171.

[4]李康,李渝成,周暾.兩種泥鰍染色體組型的比較研究[J].動物學研究,1983,4(1):75-80.

[5]印杰,趙振山,陳小奇,等.二倍體和四倍體泥鰍染色體組型比較[J].水生生物學報,2005,29(4):469-472.

[6]李雅娟,印傑,王嘉博,等.中國29の地點ドジョウにおける倍數體の分布に関する研究[J].日本水産學會誌,2008,74(2): 177-182.

[7]Li Y J,Tian Y,Zhang M Z,et al.Chromosome banding and FISH with an rDNA probe in the diploid and tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus[J].Ichthyological Research,2010,57(4):358-366.

[8]Li Y J,Yu Z,Zhang M Z,et al.The origin ofnatural tetraploid loach Misgurnus anguillicaudatus(Teleostei:Cobitidae)inferred from meiotic chromosome configurations[J].Genetica,2011,139:805-811.

[9]Li Y J,Yu Z,Zhang M Z,et al.Induction of viable gynogenetic progeny using eggs and UV-irradiated sperm from the Chinese tet?raploid loach,Misgurnus anguillicaudatus[J].Aquaculture Inter?national,2013,21:759-768.

[10]Li Y J,Zhang M Z,Qian C,et al Fertility and ploidy of gametes of diploid,triploid and tetraploid loaches,Misgurnus anguillicauda?tus,in China[J].Journal of Applied Ichthyology,2012(28):900-905.

[11]Zhao Y,Toda M,Hou J K.The occurrence of hypertetraploid and other unusual polyploid loaches Misgurnus anguillicaudatus among market specimens in Japan[J].Fish Sci,2012,78:1219-1227.

[12]林義浩.快速獲得大量魚類腎細胞中期分裂相體內注射法[J].水產學報,1982,6(3):201-204.

[13]張四明.一種制備魚類染色體的新方法[J].遺傳,1993,15(3): 35-36.

[14]Levan A,Fredga K,Sandberg A A.Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J].Hereditas,1964,52(2):201-220.

[15]單仕新,梁紹昌.蔣一珪,等.三倍體方正銀鯽(♂)同二倍體紅鯽(♀)雜交胚胎的非整倍體發(fā)育[J].水產學報,1985,9(2): 199-201.

[16]Zhang Q,Arai K.Aberrant meioses and viable aneuploid progeny of induced triploid loach(Misgurnsus anguillicaudatus)when crossed tonatural tetraploids[J].Aquaculture,1999b,175:63-76.

[17]Wang Z,Guo X,Allen S K,et al.Aneuploid Paeific oys?ter(Crassostrea gigas Thunberg)as ineidentals from triploid Produ?etion[J].Aquaeulture,1999,173:347-357.

[18]Guo X,Zhang G,Landau B J,et al.Aneuploidy in the Pacifie oys?ter(Crassostrea gigas Thunberg)and itse ffeets on growth[J].Jour?nal of Shellfish Research,2000,19(l):614-619.

[19]何毛賢,林岳光,沈琪,等.合浦珠母貝四倍體誘導過程中非整倍體的產生[J].熱帶海洋,2000,19(4):59-64.

[20]Fujino K,Arai K,Iwadare K,et al.Induetion of gynogenetie dip?loid by inhibiting second meiosls in the Paeifica balone[J].Nip?pon Suisan Gakkaishi,1990,56(11):1755-1763.

[21]Guo X,Allen S K.Jr.Sex and meiosis in autoletraploid Pacific oyster(Crassostrea gigas Thunberg)[J].Genome,1997,40:397-405.

[22]姜波,王昭萍,于瑞海,等.雜交三倍體太平洋牡蠣群體的染色體數目組成初步觀察[J].中國海洋大學學報,2007,37(2): 255-258.

[23]Allen S K Jr,Guo X,Burreson G,et al.Heteroploid mosaics and reversion among triploid oysters,Crassostrea gigas:Fact or artifact [J].Journal of Shellfish Research,1996,15(2):514-522.

Chromosome karyotype analysis of different developmental stages F1 by diploid loach×tetraploid loach/

ZHOU He1,MA Haiyan1,ZHAO Rui2,JIANG Zhenhua1, LIN Zhongqiao1,QIAN Cong1,LI Yajuan1(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian Liaoning 116023, China;2.Fisheries Technology Extension Station of Beijing,Beijing 101105,China)

Chromosomal karyotype of early embryos,six month age sample and twelve month age sample were analyzed by different ploidy from the cross of hybridtriploid loach in the Yangtze River China natural tetraploid loach as male parent,Dalian farmers market diploid loach as female parent.The results showed that karyotype and fundamental number were determined to be 3n=75,16M+7SM+52T,NF=98 in triploid,3n=73,15M+6SM+52T,NF=94 in sub-triploid,3n=76,16M+6SM+54T,NF=98 in super triploid,3n= 75,15M+6SM+54T,NF=96 in triploid of six month age,3n=72,15M+6SM+51T,NF=93 in sub-triploid of six month,3n=77,15M+6SM+56T,NF=98 in super triploid of six month age,3n=75,12M+8SM+55T,NF=95 intriploid of twelve month age,3n=71,16M+6SM+49T,NF=93 in sub-triploid of twelve month age,3n=76, 18M+8SM+50T,NF=102 in super triploid of twelve month age.The results showed that hybrids(diploid loach×tetraploid loach)were triploid with the same chromosome number 3n=75(three sets of chromosomes) in different developmental stages,but polymorphism on karyotype.The number and the type of chromosome (increase and deletion)are no rules in aneuploid(hypertriploid and hypotriploid).

diploid loach;tetraploid loach;F1;different development stages;chromosome karyotype

S966.4；Q343.2+4

A

1005-9369（2015）07-0070-06

時間2015-7-9 14:42:52[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150709.1442.014.html

周賀,馬海艷,趙睿,等.二倍體泥鰍×四倍體泥鰍F1不同發(fā)育階段染色體核型分析[J].東北農業(yè)大學學報,2015,46(7)∶70-75.

Zhou He,Ma Haiyan,Zhao Rui,et al.Chromosome karyotype analysis of different developmental stages F1by diploid loach×tetraploid loach[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(7)∶70-75.(in Chinese with English abstract)

2015-01-22

國家自然科學基金（31272650）

周賀（1985-），女，講師，博士，研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail:zhouhe@dlou.edu.cn

*通訊作者：李雅娟，教授，碩士生導師，研究方向為水產動物遺傳育種。E-mail:liyajuan@dlou.edu.cn