黃密密楊春歐超鄭海平

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

基礎(chǔ)研究

大鼠肝癌組織中DLC1、ASC、p16和DLK1基因甲基化狀態(tài)與肝癌的關(guān)系

黃密密1，2楊春1歐超1鄭海平3

作者單位：530021南寧1廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；2廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院；3廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

目的探討大鼠肝癌組織中DLC1、ASC、p16和DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與肝癌發(fā)生的關(guān)系。方法55只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為黃曲霉毒素月1（Aflatoxin月1，AF月1）實(shí)驗(yàn)組（35只）和空白對(duì)照組（20只），用AF月1誘發(fā)大鼠肝癌并建立大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝癌模型。用甲基化特異性PCR（MS-PCR）技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)大鼠肝癌組織及正常肝臟組織中DLC1、ASC、p16和DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化情況，分析4個(gè)基因的甲基化狀態(tài)與肝癌發(fā)生的關(guān)系。結(jié)果在實(shí)驗(yàn)第52周可見(jiàn)大鼠肝臟發(fā)生典型的肝癌病理學(xué)改變，實(shí)驗(yàn)誘發(fā)大鼠肝癌模型制作成功。MS-PCR技術(shù)檢測(cè)顯示在大鼠肝癌組織中DLC1、ASC、p16和DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率分別為83.3%、93.3%、86.7%和10.0%，在大鼠正常肝臟組織中的甲基化率分別為14.3%、35.7%、21.4%和85.7%，二者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)顯示4種基因甲基化均為陽(yáng)性。結(jié)論大鼠肝癌組織中DLC1、ASC、p16基因啟動(dòng)子區(qū)高度甲基化，DLK1基因啟動(dòng)子呈低甲基化水平，提示DLC1、ASC、p16和DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化與大鼠肝癌發(fā)生的關(guān)系密切。

肝腫瘤；DLC1；ASC；p16；DLK1；基因；甲基化

原發(fā)性肝癌（primary liver carcinoma，PLC簡(jiǎn)稱“肝癌”）具有起病隱匿、臨床癥狀和體征不典型、病情進(jìn)展迅速的特點(diǎn)，從而導(dǎo)致其發(fā)病率和死亡率逐年升高［1］。我國(guó)廣西扶綏縣2004～2008年肝癌發(fā)病率為67.26/10萬(wàn)［2］，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。PLC的發(fā)生、發(fā)展是各種因素共同作用的結(jié)果。近年研究表明，肝癌的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)的改變密切相關(guān)，其中DNA甲基化是其重要的表現(xiàn)形式之一。腫瘤相關(guān)基因甲基化異常在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［3］。DNA甲基化主要是通過(guò)甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）在DNA的CpG二核苷酸的胞嘧啶上，沒(méi)有改變基因的序列，這和基因突變、雜合性缺失有別，在某些情況下是抑癌基因失活的惟一機(jī)制［4］，但這個(gè)過(guò)程是可逆的。因此探討腫瘤相關(guān)基因甲基化異常與肝癌的關(guān)系，有助于對(duì)肝癌病因?qū)W的研究。本實(shí)驗(yàn)建立大鼠肝癌動(dòng)物模型，以甲基化特異性PCR技術(shù)（methylation-specific PCR，MS-PCR）檢測(cè)大鼠肝癌組織和正常肝臟組織中DLC1、ASC、p16和DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，探討其與肝癌的關(guān)系，為研究肝癌的發(fā)生機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

黃曲霉毒素月1（Aflatoxin月1，AF月1）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；DNA甲基化試劑盒購(gòu)自北京天漠科技開(kāi)發(fā)有限公司；Premix Taq（含染料）購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖購(gòu)自西班牙月iowest公司；50xTAE購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；GoldViewⅡ型核酸染料購(gòu)自北京索萊寶公司；20bp DNA Ladder（Dye Plus）購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品（型號(hào)為PXE0.2）；凝膠成像分析系統(tǒng)為美國(guó)月IO-RAD公司產(chǎn)品（型號(hào)為731月RO1393）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 大鼠肝癌模型的建立

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可。55只Wistar雄性大鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK桂2003-0003，符合國(guó)標(biāo)G月14922-94 SPF級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。大鼠為4周齡，體重為40～60 g，標(biāo)準(zhǔn)化光照和自由進(jìn)食及飲水，分籠飼養(yǎng)并適應(yīng)環(huán)境3周。大鼠隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組35只和空白對(duì)照組20只。實(shí)驗(yàn)組大鼠于第4周開(kāi)始腹腔注射AF月1（200μg/kg），1～3次/周，至52周結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼以顆粒飼料，自由飲用滅菌飲用水?？瞻讓?duì)照組大鼠僅以大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，并自由飲用滅菌飲用水。動(dòng)物飼料、飲用水、籠具均經(jīng)過(guò)紫外線消毒和高壓滅菌處理。實(shí)驗(yàn)第52周全部處死大鼠，取肝臟保存并做病理組織學(xué)檢查。

1.3 甲基化特異性PCR技術(shù)檢測(cè)基因的甲基化

在NC月I上找到相應(yīng)基因的啟動(dòng)子序列，然后用MethPrimer軟件設(shè)計(jì)每個(gè)基因的甲基化引物。DLC1上游引物為5′-TTT-TATAGGGTGGGATTATTTATTTTTC-3′，下游引物為5′-TTTTTCAATTTCTACTCTACACGAA-3′，產(chǎn)物大小為184 bp；ASC上游引物為5′-GTTTTTAAATTTTCGGGATGTTTC-3′，下游引物為5′-ACCTAACAATAAC-AAATTCTCCGTA-3′，產(chǎn)物大小為200 bp；p16上游引物為5′-AAGATATTTTTTGAGGTTTTTATGATC-3′，下游引物為5′-CTATATACCATACTCCGACCGAC-3′，產(chǎn)物大小為266 bp；DLK1上游引物為5′-TTAGTGGTTTTTTGTGTTTATAGGC-3′，下游引物為5′-AACA-AACCTTAATACCTACTCCCG-3′，產(chǎn)物大小為166 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大鼠肝臟組織10～30mg，研碎為細(xì)胞懸液，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作提取組織DNA。提取的DNA測(cè)定其純度和濃度，并保存在-20℃，備用。按照DNA甲基化試劑盒說(shuō)明書(shū)取20μl DNA（最佳濃度為200～500 ng）進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，此時(shí)DNA中發(fā)生甲基化的CpG經(jīng)過(guò)修飾后不變，未發(fā)生甲基化的CpG中的5′端的胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏?。然后用?jīng)過(guò)修飾后的DNA作為PCR模版。甲基化特異性PCR反應(yīng)在美國(guó)Thermo公司的普通PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)體系為50μl，亞硫酸氫鹽處理的DNA 3μl，甲基化上下游引物（10μmol/L）各1μl，Premix Taq（TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye）25μl，dd H2O 20μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min，95℃40 s，58℃45 s，72℃45 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。每份亞硫酸氫鹽處理的DNA樣本均在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因的甲基化

稱取1.6 g的瓊脂糖加入40 m l 1×TAE的燒瓶里，輕輕振蕩，微波爐加熱至溶液呈透明無(wú)顆粒狀，待冷卻至50～60℃時(shí)加入8μl的GoldviewⅡ型核酸染料，輕輕搖動(dòng)燒瓶，使溶液混勻后勻速倒入制膠槽，靜置待凝，制成4%瓊脂糖凝膠。取Mark 8μl，擴(kuò)增產(chǎn)物5μl上樣，在盛有1×TAE的電泳緩沖液的電泳槽里跑膠，電壓為120 V，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析處理，在紫外線燈下觀察分析結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝癌模型的誘癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠肝癌模型。在誘癌過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)第49周實(shí)驗(yàn)組大鼠35只死亡3只，死亡率為8.6%（3/35），對(duì)照組20只中死亡6只（30%）。至第52周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠成瘤率為85.7%（30/35）。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟組織出現(xiàn)各種異常增生灶以及增生結(jié)節(jié)，其中大部分為嗜酸性結(jié)節(jié)，細(xì)胞核增大，染色質(zhì)深染，出現(xiàn)雙核或多核現(xiàn)象，核質(zhì)比增大，呈不典型增生現(xiàn)象，肝癌細(xì)胞出現(xiàn)。對(duì)照組大鼠肝臟組織表面光滑，色澤鮮艷，質(zhì)軟，顯微鏡下觀察肝臟組織未見(jiàn)異常。

2.2大鼠肝癌組織及正常肝臟組織基因的甲基化狀態(tài)

MS-PCR法檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝癌組織DLC1、ASC、p16和DLK1基因甲基化率分別為83.3%（25/30）、93.3%（28/30）、86.7%（26/30）和10.0%（3/30），對(duì)照組大鼠正常肝臟組織4種基因的甲基化率分別為14.3%（2/14）、35.7%（5/14）、21.4%（3/14）和85.7%（12/14）。兩組基因的甲基化率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

采用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DLC1、ASC、p16和DLK1基因的甲基化狀態(tài)，以DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。結(jié)果顯示DLC1、ASC、p16和DLK1的目的條帶分別為184 bp、200 bp、266 bp和166 bp。如圖1所示，出現(xiàn)相應(yīng)的目的條帶均為基因甲基化陽(yáng)性。

表1 大鼠肝癌組織及正常肝臟組織中4種基因的甲基化情況［n（%）］

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)4個(gè)基因的甲基化狀態(tài)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)［5］，腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化可以通過(guò)招募甲基化結(jié)合蛋白及相關(guān)復(fù)合物，改變?nèi)旧|(zhì)空間結(jié)構(gòu)，阻止基因轉(zhuǎn)錄，使腫瘤抑制基因沉默，同時(shí)使原癌基因甲基化水平下降，轉(zhuǎn)錄激活，而此時(shí)相關(guān)基因的DNA序列并沒(méi)有發(fā)生改變，因此腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化和原癌基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化水平與腫瘤形成密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DLC1、ASC、p16和DLK1基因在大鼠肝癌組織中存在啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化狀態(tài)，其中DLC1、ASC和p16 3種基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化，而DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)呈低甲基化，表明基因的甲基化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。

DLC1是一種重要的抑癌基因，因該基因在肝癌組織中呈低表達(dá)而得名。張素青等［6］研究肝癌患者血清DLC1基因甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）血清標(biāo)本中DLC1基因甲基化率為12.33%，而正常人血清中未檢測(cè)到DLC1基因甲基化。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示大鼠肝癌組織中DLC1基因的甲基化率為83.3%（25/30），正常肝臟組織中的甲基化率為21.4%（3/14），二者差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明DLC1基因的廣泛甲基化與肝癌關(guān)系密切。此外，本實(shí)驗(yàn)大鼠肝癌是由AF月1誘導(dǎo)形成的。張友才等［7］研究表明AF月1誘導(dǎo)的肝癌組織中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3（DNA methyltransferase 3，DNMT3）的表達(dá)明顯高于正常、損傷和早期癌變的肝臟組織。因此AF月1促進(jìn)產(chǎn)生大量的DNMT3，使DLC1啟動(dòng)子區(qū)不斷被甲基化，抑制DLC1蛋白的表達(dá)合成，導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接力減弱，細(xì)胞易于游離，特別是癌細(xì)胞，由于其生長(zhǎng)旺盛，更容易轉(zhuǎn)移。到目前為止，很多實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)DLC1基因在多數(shù)腫瘤組織中的表達(dá)抑制或缺失［8］，CpG島甲基化修飾是主要的原因之一。有研究表明去甲基化藥物可以有效預(yù)防某些腫瘤的轉(zhuǎn)移，這說(shuō)明DLC1基因?qū)σ种颇[瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有一定作用，而且甲基化也可能是其表達(dá)缺失的惟一原因［9］。

ASC基因是一個(gè)與凋亡有關(guān)的基因，它在許多正常組織中如結(jié)腸、甲狀腺、脾、小腸、肺、胃、乳腺、上皮細(xì)胞等都有表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞中包括前列腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱移行細(xì)胞癌和乳腺癌等都有不同程度的缺失現(xiàn)象。白彧等［10］檢測(cè)58例HCC組織中ASC基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示40例發(fā)生ASC基因甲基化，甲基化率為69%，而在正常肝臟組織中未見(jiàn)異常，提示ASC基因啟動(dòng)子甲基化是HCC中的頻發(fā)事件，出現(xiàn)這些情況不排除是由于ASC的甲基化抑制了基因的表達(dá)，使其沉默。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，大鼠肝癌組織中的ASC基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯高于正常組織中的甲基化率（P＜0.05），提示ASC基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化與肝癌的發(fā)生有關(guān)。其可能的原因是ASC基因主要參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，它可防止細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，維持機(jī)體處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，而一旦基因甲基化異常則將打破這種平衡狀態(tài)，給腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)和環(huán)境。

抑癌基因p16是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）基因家族的成員之一，是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，其失活可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，細(xì)胞周期加速，使DNA在未被修復(fù)前過(guò)早地進(jìn)入S期，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。2008年Ko等［11］檢測(cè)265例HCC患者組織樣本，結(jié)果顯示p16基因啟動(dòng)子區(qū)的異常高甲基化率達(dá)67%，提示它與肝癌發(fā)生密切相關(guān)。亓云鵬等［12］研究表明，肝癌組織中p16基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化頻率明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p16在肝癌組織中的甲基化率為86.7%，在正常肝臟組織中為21.4%，二者差異顯著（P＜0.05），這和國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果一致。其機(jī)制可能是由于肝癌組織中p16基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化后抑制p16基因的表達(dá)，使細(xì)胞分裂時(shí)不能得到精確地調(diào)節(jié)，能順利通過(guò)細(xì)胞周期中的G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)入細(xì)胞分裂、增殖期，導(dǎo)致細(xì)胞選擇優(yōu)勢(shì)性無(wú)限增殖，最終形成肝癌。

DLK1基因是表皮生長(zhǎng)因子的家族成員之一，屬于父系表達(dá)母系沉默的印記基因，從鳥(niǎo)類到哺乳動(dòng)物都存在，在大部分成年哺乳動(dòng)物中處于沉默狀態(tài)，主要在胚胎組織中高度表達(dá)。新近研究表明，DLK1基因的表達(dá)能誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化潛能［13］，這表明DLK1基因高峰表達(dá)期在動(dòng)物各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育期，而在成年則處于抑制狀態(tài)，一旦調(diào)節(jié)失控如甲基化異常等，該基因就會(huì)出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致組織細(xì)胞異常增生，從而形成腫瘤。Luo等［14］研究發(fā)現(xiàn)，DLK1基因在肝癌組織中表達(dá)，而在正常肝臟組織中完全不表達(dá)。相關(guān)的動(dòng)物研究［15］也發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的成瘤能力隨DLK1基因的表達(dá)水平升高而增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示肝癌組織中DLK1基因的甲基化率明顯低于正常肝臟組織中的甲基化率，推測(cè)DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化水平使DLK1大量表達(dá)，使細(xì)胞處于原始發(fā)育水平，不斷增殖，最終形成腫瘤。

綜上所述，ASC、DLC1、p16及DLK1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，在肝癌組織中均存在4個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化異常狀態(tài)，可能在肝癌早期或在癌變前即已發(fā)生這種改變，其與肝癌的發(fā)生、發(fā)展相輔相成。但由于基因甲基化的改變是可逆的，因此恢復(fù)基因的正常甲基化狀態(tài)有望成為逆轉(zhuǎn)及治療腫瘤的新方向。

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［2014-11-20收稿］［2014-12-22修回］［編輯阮萃才］

Analysis of DLC1，ASC，p16 and DLK1 genemethylation in a ratmodel of liver cancer

HUANG Mimi1，2，YANG Chun1，OU Chao1，ZHENG Haiping3（1Research Department of Guangxi Cancer Institute；2Graduate School of Guangxi Medical University；3Department of Oncology，The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

YANG Chun.E-mail：cxl_yang@163.com

ObjectiveTo study the potential association between liver cancer and methylation of the promoters of the genes DLC1，ASC，p16，andDLK1.M ethodsPrimary hepatocellular carcinoma（PHC）was induced in 35Wistar rats by injection of AF月1.Another group of 20 rats

no drug and served as a negative control.Atweek 52，all rats were killed and tissue samples were harvested and analyzed for histopathology.Methylation-specific PCR was used to analyze methylation of the promoters of the genes DLC1，ASC，p16，and DLK1 in rat liver in both groups.ResultsAF月1-induction of PHC led to the expected pathological changes in rat liver. Methylation rates of DLC1，ASC，p16 in liver tissue were significantly higher in ratswith PHC（83.3%，93.3%，86.7%，respectively）than in control rats（14.3%，35.7%，21.4%；all P＜0.05），whereas the oppositewas true formethylation rates of DLK1（10.0%vs 85.7%，P＜0.05）.ConclusionPHC may be associated with upregulation of DLC1，ASC，and p16 methylation，as well as downregulation of DLK1methylation.Thus，aberrantmethylation of DLC1，ASC，p16 and DLK1 may contribute to PHC onset and progression.

Liver neoplasm；DLC1；ASC；p16；DLK1；Gege；Methylation

R734.2

A

1674-5671（2015）02-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.02.03

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2012GXNSFAA053167）；廣西自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（2014GXNSF月A118193）；廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（GXMUYSF201218）

楊春。E-mail：cxl_yang@163.com