任麗萍，藺娟，閔祺，廖海明，楊洪淼，范慧紅Δ

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830004；3.遼寧錦州市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121000)

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多烯酸乙酯軟膠囊的抗氧化劑研究

任麗萍1，藺娟2，閔祺3，廖海明1，楊洪淼1，范慧紅1Δ

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830004；3.遼寧錦州市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 錦州 121000)

目的 分析比較多烯酸乙酯軟膠囊國(guó)內(nèi)外同類(lèi)產(chǎn)品的過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值以考察其氧化穩(wěn)定性。方法 采用TSK gel ODS-100V色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇—水(98:2，V/V)測(cè)定多烯酸乙酯軟膠囊樣品中維生素E的結(jié)構(gòu)形式；初步評(píng)價(jià)生育酚醋酸酯、α-生育酚作為輔料對(duì)ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)藥物抗氧化作用的影響。結(jié)果 國(guó)產(chǎn)樣品中添加的抗氧化劑的主要結(jié)構(gòu)形式為醋酸酯結(jié)構(gòu)，國(guó)外同類(lèi)樣品抗氧化劑主要為游離的α-生育酚；生育酚醋酸酯的抗氧化效果不如生育酚的效果佳，維生素E的結(jié)構(gòu)形式對(duì)ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)藥物抗氧化作用有直接影響。結(jié)論 本研究為科學(xué)評(píng)價(jià)多烯酸乙酯軟膠囊中抗氧化劑添加的合理性提供了依據(jù)，對(duì)有效控制該類(lèi)藥品質(zhì)量具有積極意義。

多烯酸乙酯軟膠囊；抗氧劑；抗氧化作用；維生素E；α-生育酚 ；生育酚醋酸酯

多烯酸乙酯軟膠囊為ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)降脂藥，其原料和制劑均為《中國(guó)藥典》2010年版二部新增品種[1]。該藥為國(guó)家非基本藥物，在部分地區(qū)醫(yī)保目錄乙類(lèi)品種中收載。美國(guó)藥典(USP37)收載同類(lèi)品種ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)原料和軟膠囊劑，日本藥局方(JP16)收載同類(lèi)品種二十碳五烯酸乙酯原料藥，歐洲藥典(EP8.0)收載同類(lèi)品種ω-3多不飽和脂肪酸乙酯60、90系列原料藥。2014年本院承擔(dān)了對(duì)多烯酸乙酯軟膠囊的國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)工作。

ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)藥物的主要有效成分為二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯，2者化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有較多的不飽和雙鍵，在加工和運(yùn)輸過(guò)程中易受到氧氣、光照和水分等因素的作用而發(fā)生酸敗[2-3]。因此氧化穩(wěn)定性是衡量該類(lèi)藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)，藥品中添加的抗氧化劑又與藥品的氧化穩(wěn)定性緊密相關(guān)?！吨袊?guó)藥典》2010年版注明該藥處方由多烯酸乙酯原料和適量穩(wěn)定劑組成，但未對(duì)穩(wěn)定劑種類(lèi)和量有更詳細(xì)的說(shuō)明。在調(diào)研過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)企業(yè)添加的穩(wěn)定劑主要為維生素E，各企業(yè)的添加量存在較大差別，濃度范圍大約為0.5%～3%。該添加量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)外同類(lèi)品種所標(biāo)明的 0.1%～0.4%濃度，與多烯酸乙酯軟膠囊所不同的是，國(guó)外品種所添加的抗氧劑為α-生育酚。

維生素E是一種脂溶性的維生素，由于取代基位置的不同存在α、β、γ、δ四種異構(gòu)體，根據(jù)酚羥基是否酯化可分為生育酚與生育酚醋酸酯[4]，中國(guó)藥典中收載的維生素E就是以醋酸酯的形式存在[1]。多烯酸乙酯軟膠囊藥品所使用的抗氧化劑維生素E是何種結(jié)構(gòu)形式？它與國(guó)外藥品使用的α-生育酚有何區(qū)別？2者對(duì)該類(lèi)藥品的氧化穩(wěn)定性有何影響？2者的抗氧化作用哪種更強(qiáng)？針對(duì)以上問(wèn)題，本研究在對(duì)國(guó)內(nèi)外同類(lèi)藥品的氧化穩(wěn)定性指標(biāo)過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值結(jié)果進(jìn)行比較分析的基礎(chǔ)上，對(duì)該品種所添加抗氧劑維生素E的結(jié)構(gòu)形式以及不同結(jié)構(gòu)的維生素E的抗氧化能力進(jìn)行考察，旨在為科學(xué)評(píng)價(jià)該類(lèi)藥物抗氧化劑添加的合理性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀： SPD-20A檢測(cè)器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵(日本島津公司)。

1.2 藥品與試劑 2014年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)的6個(gè)廠(chǎng)家共26批樣品；維生素E輔料4批(國(guó)內(nèi)4家制劑生產(chǎn)企業(yè)提供)；多烯酸乙酯原料樣品(國(guó)內(nèi)企業(yè)A提供)；二十碳五烯酸乙酯原料3批(進(jìn)口企業(yè)A)；二十碳五烯酸乙酯軟膠囊3批(進(jìn)口企業(yè)B)；α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(日本藥局方)；生育酚醋酸酯對(duì)照品(sigma公司)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3 過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值測(cè)定方法 取多烯酸乙酯軟膠囊5個(gè)企業(yè)25批次樣品，二十碳五烯酸乙酯軟膠囊3批樣品，按照《中國(guó)藥典》2010年版二部多烯酸乙酯軟膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值方法[1]測(cè)定，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件繪制各企業(yè)所有批次的過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值箱式圖。

1.4 國(guó)產(chǎn)制劑輔料中維生素E結(jié)構(gòu)形式的考察

1.4.1 色譜條件：色譜柱：TSK gel ODS-100V色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；流動(dòng)相:甲醇:純水=98:2；流速：1.0 mL，等度洗脫。

1.4.2 對(duì)照品及供試品溶液的制備：取生育酚醋酸酯對(duì)照品、α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品、企業(yè)提供維生素E輔料各50 mg，分別置于棕色50 mL容量瓶中，加入甲醇并定容，采用0.45 μm針頭濾器進(jìn)行過(guò)濾。各樣品進(jìn)樣20 μL。

1.5 生育酚醋酸酯與游離α-生育酚對(duì)油脂氧化影響

1.5.1 供試品的制備：模擬國(guó)外制劑處方，加入α-生育酚到多烯酸乙酯原料中，混勻后置于表面皿中，制備0.1%、0.2%的α-生育酚共2個(gè)濃度水平的多烯酸乙酯制劑；模擬國(guó)內(nèi)制劑處方，加入生育酚醋酸酯到多烯酸乙酯原料中，混勻后置于表面皿中，制備1%、3%的生育酚醋酸酯共2個(gè)濃度水平的多烯酸乙酯制劑，取多烯酸乙酯原料藥空白對(duì)照。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)方法：將所有樣品置于紫外燈下照射，照射2 h(功率40 w，垂直距離60 cm)，取出后置于65 ℃恒溫烘箱中誘導(dǎo)氧化酸敗。每隔24 h，將樣品取出置于紫外燈下照射2 h，然后復(fù)置于65 ℃恒溫烘箱中繼續(xù)誘導(dǎo)，連續(xù)照射5 d，分別于第0、1、2、3、4、5天取樣充氮保存，考察樣品外觀(guān)性狀及過(guò)氧化值的變化。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值測(cè)定結(jié)果 所有批次樣品的過(guò)氧化值均小于15.0，甲氧基苯胺值均小于30.0。國(guó)內(nèi)外不同企業(yè)樣品的過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值的箱式圖分別見(jiàn)圖1、圖2。從圖中可以看出國(guó)內(nèi)企業(yè)的過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值均高于國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)同一企業(yè)不同批次間樣品的過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值均存在較大差異。

圖1 不同生產(chǎn)單位樣品過(guò)氧化值箱式圖Fig.1 Comparison of peroxide value of ethyl polyenoate soft capsules from different manufactures

圖2 不同生產(chǎn)單位樣品甲氧基苯胺值箱式圖Fig.2 Comparison of anisidine value of ethyl polyenoate soft capsules from different manufactures

2.2 國(guó)產(chǎn)制劑輔料中維生素E結(jié)構(gòu)形式的考察結(jié)果 α-生育酚、生育酚醋酸酯對(duì)照品及供試品溶液的HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。由4家企業(yè)提供的輔料其維生素E主要結(jié)構(gòu)形式為生育酚醋酸酯，進(jìn)口企業(yè)樣品中的抗氧化劑為α-生育酚。

圖3 對(duì)照品及供試品溶液的HPLC色譜圖1.α-生育酚；2.生育酚醋酸酯；a.進(jìn)口EPA乙酯軟膠囊；b-e.4家國(guó)內(nèi)企業(yè)提供維生素E輔料；f.生育酚醋酸酯對(duì)照品；g.α-生育酚對(duì)照品Fig.3 HPLC chromatograms of reference substance and sample solution1.α-tocopherol；2.tocopherol acetate；a.imported ethyl icosapentate soft capsules；b-e.vitamin E as excipient supplied by four kinds of domestic manufactures of ethyl polyenoate soft capsules；f.tocopherol acetate reference substance；g.α-tocopherol reference substance

2.3 生育酚醋酸酯與游離α-生育酚對(duì)油脂氧化影響結(jié)果 不同濃度水平的α-生育酚與生育酚醋酸酯對(duì)多烯酸乙酯藥品性狀的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，與第1天樣品相比，第4天取樣時(shí)，加入1%、3%的生育酚醋酸酯的國(guó)內(nèi)處方模擬組均發(fā)生明顯的色變；加入0.1%的α-生育酚的國(guó)外處方模擬組產(chǎn)生色變，但顏色淺于對(duì)照組和國(guó)內(nèi)處方模擬組；加入0.2%的α-生育酚的國(guó)外處方模擬組顏色未產(chǎn)生色變。加入1%、3%的生育酚醋酸酯的國(guó)內(nèi)處方模擬組在實(shí)驗(yàn)中色變與對(duì)照組比沒(méi)有明顯的區(qū)別。

不同濃度水平的α-生育酚與生育酚醋酸酯對(duì)多烯酸乙酯藥品過(guò)氧化值的影響見(jiàn)圖5。由圖5可知，國(guó)內(nèi)處方模擬組和對(duì)照組樣品在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)的過(guò)氧化值一直處于上升趨勢(shì)，與以上3組樣品過(guò)氧化值變化相比，國(guó)外處方模擬組樣品中的α-生育酚的存在減緩了樣品氧化過(guò)程。

圖4 不同濃度α-生育酚與生育酚醋酸酯對(duì)外觀(guān)性狀的影響Fig.4 The effect of α-tocopherol and tocopherol acetate with different concentrations on appearance

圖5 不同濃度α-生育酚與生育酚醋酸酯對(duì)過(guò)氧化值的影響Fig.5 The effect of α-tocopherol and tocopherol acetate with different concentrations on peroxide value

3 討論

3.1 影響藥物氧化穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇[5]油脂的氧化過(guò)程是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程。油脂的自動(dòng)氧化，最先經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)期，在此階段，主要生產(chǎn)第一級(jí)產(chǎn)物過(guò)氧化物；其次經(jīng)過(guò)氧化期，在這一階段，主要生成第二級(jí)氧化產(chǎn)物，如醇類(lèi)及羧基化合物，并進(jìn)一步分解物羧酸，在此期間可以檢測(cè)到過(guò)氧化值、揮發(fā)性反應(yīng)物及氧吸收顯著增加[6-8]，在此階段，反應(yīng)會(huì)比較迅速，且油脂開(kāi)始劣變，此為誘導(dǎo)期終點(diǎn)。油脂的誘導(dǎo)期到氧化期之間時(shí)間的長(zhǎng)短表明油脂抗氧化能力的強(qiáng)弱，即氧化穩(wěn)定性的好壞。油脂的穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)指標(biāo)種類(lèi)較多，有過(guò)氧化值、脂肪酸組成、酸值等。其中，過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值由于具有適用范圍廣，測(cè)定方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。因此在評(píng)價(jià)油脂類(lèi)藥物的氧化穩(wěn)定性研究中被廣泛應(yīng)用，本研究中采用過(guò)氧化值及甲氧基苯胺值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 藥物氧化穩(wěn)定性的影響因素 與一般的魚(yú)油保健品所不同的是，多烯酸乙酯軟膠囊中不飽和脂肪酸的二十碳五烯酸乙酯和二十二碳六烯酸乙酯的含量高達(dá)80%以上，因此作為藥品使用的多烯酸乙酯更容易發(fā)生氧化。因此在藥品的提取、精制、運(yùn)輸和貯藏以及進(jìn)一步加工過(guò)程中，需要隨時(shí)防止氧化?？諝庵醒鯕獾拇嬖谑茄趸闹饕獥l件，紫外線(xiàn)、高溫甚至金屬離子是促進(jìn)氧化的因素，都應(yīng)盡量避免。在其他影響因素不能改變的條件下，添加合適抗氧化劑能夠適當(dāng)減緩多不飽和脂肪酸的氧化，但抗氧化的機(jī)理因抗氧化劑的不同而異。若由于抗氧化劑的使用不當(dāng)，會(huì)造成抗氧化效果不佳，甚至比不加更壞。因此，不同企業(yè)由于原料的提純工藝、中間體的貯存及運(yùn)輸條件有所不同，應(yīng)根據(jù)各自工藝條件摸索適合的抗氧化劑。

氧化穩(wěn)定性是ω-3多不飽和脂肪酸乙酯類(lèi)藥物質(zhì)量控制所面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。本文采用HPLC-UV方法對(duì)國(guó)內(nèi)外藥品中抗氧化劑維生素E結(jié)構(gòu)形式進(jìn)行測(cè)定，并比較了以醋酸酯和游離態(tài)2種結(jié)構(gòu)形式的維生素E的抗氧化作用。研究結(jié)果表明國(guó)內(nèi)藥品中的抗氧化劑主要是以生育酚醋酸酯形式存在的維生素E，其抗氧化作用不如國(guó)外同類(lèi)品種中使用的抗氧化劑α-生育酚的效果佳，初步作出了抗氧化劑的使用不當(dāng)可能是國(guó)內(nèi)藥品的氧化穩(wěn)定性與國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品存在差距的判斷，但由于已有的HPLC-UV方法靈敏度很低，無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定國(guó)產(chǎn)樣品中α-生育酚的含量，為進(jìn)一步確證該項(xiàng)判斷，本研究還建立了高效液相色譜-熒光檢測(cè)法考察我國(guó)藥品中添加的生育酚的種類(lèi)和水平，該項(xiàng)研究結(jié)果將后續(xù)報(bào)道。綜合以上研究，建議國(guó)內(nèi)的多烯酸乙酯軟膠囊生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)展該品種的抗氧化劑研究，進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)品處方，以提高該類(lèi)品種的氧化穩(wěn)定性。

[1] 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.中華人民共和國(guó)藥典2010版二部[M].2010：272-273，907-908.

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[4] 樊明濤，吳守一，馬海樂(lè).維生素E測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，23(1)：54-57.

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(編校：王冬梅)

Study on antioxidant of ethyl polyenoate soft capsules

REN Li-ping1, LIN Juan2, MIN Qi3, LIAO Hai-ming1, YANG Hong-miao1, FAN Hui-hong1Δ

( 1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2.Xinjiang Uyghur Autonomous Region Institute for Food and Drug Control, Urumqi 830004, China; 3.Liaoning Jinzhou City Institute for Food and Drug Control, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo analyze peroxide value and anisidine value of ethyl polyenoate soft capsules and imported drugs and evaluate the oxidative stability. MethodsThe analysis was carried out on a TSK gel ODS-100 V(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-water(98:2，V/V)as the mobile phase to determine the structure of the vitamin E as antioxidant.The influence on the antioxidation effect of tocopherol acetate and α-tocopherol as excipient in omega-3 polyunsaturated fatty acid ethyl ester drugs was evaluated.ResultsThe structure of vitamin E as antioxidant in domestic drugs was acetate, while vitamin E as excipient in foreign drugs had the structure of α-tocopherol monomer.As antioxidant, the antioxidation effect of tocopherol acetate was better than α-tocopherol.The structure of vitamin E had a direct impact on the antioxidation effect of omega-3 polyunsaturated fatty acid ethyl ester drugs.ConclusionThe studies provide the basis for evaluate rationality of antioxidant in ethyl polyenoate soft capsules scientifically, which has positive significance for controlling the quality of the drug effectively.

ethyl polyenoate soft capsules; antioxidant; antioxidation effect; vitamin E; α-tocopherol; tocopherol acetate

任麗萍，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品質(zhì)量研究，E-mail：pplucky@126.com；范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥品質(zhì)量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)05-0174-03