廖雪蓮， 蔣莎義， 蔣 慧， 何海龍， 陳力軍， 謝曉恬

(1. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液/腫瘤科，上海 200062; 2. 蘇州兒童醫(yī)院血液科，江蘇 蘇州 215001;3. 山東省兒童醫(yī)院血液科，山東 濟(jì)南 250021; 4. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，上海 200065)

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·基礎(chǔ)研究·

純紅細(xì)胞再生障礙性貧血臨床特點(diǎn)與RPS19、RPL5、RPL11基因突變之多中心研究

廖雪蓮1， 蔣莎義1， 蔣 慧1， 何海龍2， 陳力軍3， 謝曉恬4

(1. 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液/腫瘤科，上海 200062; 2. 蘇州兒童醫(yī)院血液科，江蘇 蘇州 215001;3. 山東省兒童醫(yī)院血液科，山東 濟(jì)南 250021; 4. 同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科，上海 200065)

目的 通過(guò)對(duì)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血的臨床回顧與RPS19、RPL5、RPL11基因突變的檢測(cè)，分析比較先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血與獲得性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血的臨床異同和RPS19、RPL5和RPL11基因突變情況。方法 20例來(lái)自多中心的兒童純紅細(xì)胞再生障礙性貧血，先天性14例，獲得性6例，分析臨床資料并比較兩組發(fā)病年齡、外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和對(duì)治療的反應(yīng)。Sanger雙脫氧鏈終止法對(duì)患兒RPS19、RPL5和RPL11基因測(cè)序。結(jié)果 先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血42.8%伴有先天畸形，與獲得性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血比較，網(wǎng)織紅細(xì)胞較低(P<0.05)，外周血WBC、HGB和PLT無(wú)差異。激素治療有效率分別是： 先天性78.6%、獲得性100%(P<0.05)。先天性純紅再障7.1%檢出RPS19點(diǎn)突變，獲得性純紅再障未發(fā)現(xiàn)RPS19突變。先天性純紅再障和獲得性純紅再障RPL5和RPL11基因均未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論 先天性純紅再障42.8%合并畸形，網(wǎng)織紅細(xì)胞均低于獲得性純紅再障，RPS19突變率低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道。RPS19突變可能與先天性純紅再障有關(guān)。獲得性純紅再障發(fā)病與RPS19、RPL5和RPL11基因異?？赡軣o(wú)關(guān)。

純紅細(xì)胞再生障礙性貧血； 核糖體蛋白基因； 基因突變

純紅細(xì)胞再生障礙性貧血(pure red cell aplasia PRCA)，簡(jiǎn)稱純紅再障。是一類骨髓紅系增生不良性疾病，臨床以貧血、外周血紅細(xì)胞、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞減低，骨髓象幼紅細(xì)胞明顯減少或缺如為特征。分為先天性純紅再障(Diamond-BIackfan綜合征，DBA)和后天獲得性純紅再障，后者又有原發(fā)性和繼發(fā)性之分。后天獲得性純紅再障為急性自限性疾病，主要見(jiàn)于兒童。先天性和后天性純紅再障的鑒別診斷主要取決于發(fā)病年齡和先天性畸形。十年前，發(fā)現(xiàn)在部分DBA中存在核糖體蛋白S19(RPS19)基因突變[1]，而相同的突變形式在獲得性純紅再障未見(jiàn)報(bào)道。近年來(lái)，國(guó)際上還發(fā)現(xiàn)部分DBA患者除RPS19外，還伴有RPS24、RPS17、RPL5、RPL11等這些核糖體蛋白異常，提示DBA的本質(zhì)可能為核糖體疾病。純紅再障治療首選糖皮質(zhì)激素，獲得性少有復(fù)發(fā)；環(huán)孢素A(CSA)也是治療純紅再障的主要藥物之一。本研究對(duì)4家醫(yī)院近3年接診的20例純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患兒行核糖體蛋RPS19、RPL5和RPL11基因測(cè)序并做臨床分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

來(lái)自上海市兒童醫(yī)院、蘇州兒童醫(yī)院、山東省立醫(yī)院、同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科的純紅細(xì)胞再生障礙性貧血20例，年齡1個(gè)月至5歲。所有患兒在采集臨床資料、血液和骨髓標(biāo)本前均獲取了其監(jiān)護(hù)人的同意。其中先天性純紅再障14例，男8例，女6例，發(fā)病年齡出生到1歲，中位年齡5月。獲得性純紅再障6例，男女各3例，發(fā)病年齡24～60個(gè)月。隨訪6～36個(gè)月。

1.2 診斷、分型和療效標(biāo)準(zhǔn)

純紅細(xì)胞再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]： 正細(xì)胞正色素性貧血，白細(xì)胞、血小板數(shù)正?；蛏栽黾樱痪W(wǎng)織紅細(xì)胞降低；骨髓紅系各階段顯著低于正常，粒系、巨核系各階段在正常范圍內(nèi)。先天性1歲半以內(nèi)發(fā)病，常伴有畸形；繼發(fā)性多繼發(fā)于感染、藥物等。原發(fā)性實(shí)驗(yàn)室可發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞比例和免疫球蛋白異常，貧血對(duì)免疫抑制劑治療有反應(yīng)。

療效標(biāo)準(zhǔn)參照成人： 基本治愈、緩解和明顯進(jìn)步均為有效[1]，即至少達(dá)到無(wú)癥狀，無(wú)輸血依賴，血紅蛋白較治療前上升大于30g/L，維持3個(gè)月不降；無(wú)效為血紅蛋白不增或增加不到30g/L。

1.3 RPS19、RPL5及RPL11基因測(cè)序

抽取患兒外周血2ml，EDTA防凝，提取DNA(血液基因組DNA提取試劑盒)，DNA終濃度為50～100ng/μl，OD260/OD280比值介于1.7～1.9，PCR儀(GeneAmp PCR System 9700)分別擴(kuò)增RPS19、RPL5及RPL11基因片段： 上、下游引物，2×PCR MasterMix，終反應(yīng)體積25μl。Sanger法-雙脫氧鏈終止法測(cè)序： PCR產(chǎn)物純化后，測(cè)序引物3.2pmol/μl 1μl，BigDye 8μl，模板DNA 1μl，Rnase Free dH2O μl，終反應(yīng)體積20，測(cè)序PCR循環(huán)： 95℃ 5min→(95℃ 30sec →52℃ 10sec→60℃ 4min)×50個(gè)循環(huán)→4℃保溫。測(cè)序產(chǎn)物純化，上樣，基因測(cè)序儀HITACHI3500xL Genetic Analyzer(applied biosystem inc， USA)測(cè)序反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)方差及均值，均數(shù)用t檢驗(yàn)，率用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床特征

20例患兒均以貧血就診，其中先天性純紅再障(DBA)14例。6例DBA伴有畸形，5例DBA伴有畸形，包括六指、室缺、多囊腎和身材矮小，1例有白內(nèi)障和智力發(fā)育落后。其中有1例DBA患兒有家族貧血史，該患兒姐姐4個(gè)月時(shí)因貧血性疾病死亡，另1姐姐健在，無(wú)貧血。而6例獲得性純紅再障未發(fā)現(xiàn)伴有畸形，并否認(rèn)家族貧血史。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

20例純紅再障均為正細(xì)胞性貧血，發(fā)病時(shí)血紅蛋白28～70g/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞比例0.1%～0.5%。外周血象示白細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)均在正常范圍。骨髓象示： 紅系增生低下，粒系、巨核系無(wú)異常。其中17例查coombs試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性。9例查EB病毒抗體，其中包括6例獲得性純紅再障，均陰性。5例查微小病毒B19抗體(包括4例獲得性純紅再障)，均陰性。DBA發(fā)病年齡早，與獲得性純紅再障比較，網(wǎng)織紅細(xì)胞更低，而發(fā)病時(shí)血紅蛋白水平、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)等均無(wú)差異，見(jiàn)表1。

表1 DBA與獲得性純紅再障臨床異同

注： DBA，先天性純紅再障；HB，血紅蛋白；WBC，白細(xì)胞；PLT，血小板；RET，網(wǎng)織紅細(xì)胞。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2.3 治療

所有患兒初治時(shí)均每日口服糖皮質(zhì)激素潑尼松1.5～2mg·kg-1，血紅蛋白達(dá)100g/L以上后逐漸減量，小劑量維持直至停藥；4～6周無(wú)效，則停用。6例獲得性純紅再障，激素治療有效，完全恢復(fù)正常6/6(100%)，2～6個(gè)月停藥。14例DBA，皮質(zhì)激素11例有效11/14(78.6%)，3例完全停藥3/14(21.4%)，8例小劑量維持8/14(57.1%)，其中包括2例停藥后反復(fù)，再次應(yīng)用皮質(zhì)激素的患兒。獲得性激素治療的有效率高于DBA，但確切概率法，無(wú)差異(78.6%，100%)，P=0.13，可能受樣本量小影響。5例激素?zé)o效者，1例有貧血家族史，新生兒期既發(fā)病，輸血依賴；另4例加用環(huán)保霉素A(CSA)，每日3～5mg/kg，3例有效，仍在治療中，1例無(wú)效，輸血依賴。

2.4 RPS19、RPL5及RPL11基因基因測(cè)序結(jié)果

14例先天性純紅再障(DBA)患兒，檢測(cè)到1例基因突變，顯示為Exon4點(diǎn)突變： c.185G>A(p.R62Q)，其父母隨后亦行RPS19基因測(cè)序，不存在RPS19基因突變；6例獲得性純紅再障未發(fā)現(xiàn)RPS19基因突變。14例DBA和6例獲得性RPL5和RPL11基因均未發(fā)現(xiàn)突變。

3 討 論

根據(jù)正細(xì)胞性貧血，網(wǎng)織紅細(xì)胞減低和骨髓單純紅系增生不良，純紅再障診斷并不困難。但純紅再障在兒童需鑒別先天性和獲得性。前者發(fā)病年齡早并伴有多種畸形；后者可找到潛在病因和部分患兒呈自限性。

先天性純紅再障(DBA)在兒童多見(jiàn)，獲得性相對(duì)少，本組資料先天性與獲得性為7∶3。DBA大部分病例呈散發(fā)，家族病例表現(xiàn)為不全顯性的常染色體顯性遺傳。發(fā)病率為每百萬(wàn)活產(chǎn)新生兒中4～7例，大多在生后3個(gè)月內(nèi)診斷，99%于5歲前診斷。本組大多患兒于1歲內(nèi)確診，其中一例出生即發(fā)病男性患兒有貧血家族史。14例DBA中6例合并畸形，與文獻(xiàn)40%的畸形發(fā)生率相近。本組研究收集的DBA與獲得性純紅再障病例之間血紅蛋白、白細(xì)胞和血小板水平均無(wú)差異，唯先天性患兒網(wǎng)織紅細(xì)胞較低。

獲得性純紅再障又分原發(fā)性和繼發(fā)性，前者找不到病因，可能與多種異常的免疫反應(yīng)有關(guān)；后者常繼發(fā)于胸腺瘤、白血病和淋巴瘤、某些病毒感染[2]、藥物[3]、自身免疫性疾病或移植后[4]等。與成人多表現(xiàn)為慢性過(guò)程不同，兒童獲得性純紅再障臨床常表現(xiàn)為急性自限性，病因以病毒等感染為主。本組資料未發(fā)現(xiàn)EBV和微小病毒B19感染證據(jù)，可能與病例數(shù)少和有的患兒檢測(cè)時(shí)間較晚有關(guān)。

純紅再障治療首選糖皮質(zhì)激素，14例DBA強(qiáng)的松口服有效率為78%，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[5]。獲得性純紅再障6例強(qiáng)的松口服有效率100%，高于文獻(xiàn)的60%。一方面由于病例數(shù)少；另一方面，本資料僅為兒童，而文獻(xiàn)數(shù)據(jù)則是成人病例占多數(shù)；再則，因無(wú)治療前的觀察隨訪期，可能包含了自愈患兒。因10%～15%的獲得性純紅再障患者呈現(xiàn)一個(gè)自限性過(guò)程，在制定治療方案前可觀察隨訪1個(gè)月。CSA用于皮質(zhì)激素治療失敗的患兒，大部分患兒獲緩解。近來(lái)研究將CSA作為一線用藥，認(rèn)為CSA治療可以維持比糖皮質(zhì)激素更長(zhǎng)的初始緩解持續(xù)時(shí)間[6]。

RPS19是最早發(fā)現(xiàn)的與DBA相關(guān)的基因突變，大約25%的DBA患者中存在RPS19突變[7-9]。隨后又有包括RPS24、RPS17、RPS10、RPS26、RPL5、RPL11和RPL35a在1%～10%的DBA中被發(fā)現(xiàn)突變[10-12]。RPS19基因編碼蛋白為構(gòu)成核糖體40S小亞基蛋白之一，其缺陷被認(rèn)為導(dǎo)致DBA[13]。在人紅系白血病細(xì)胞TF1或CD34+祖細(xì)胞中siRNA敲除RPS19后導(dǎo)致增生減低。RPS19缺陷，斑馬魚(yú)生長(zhǎng)遲緩、紅細(xì)胞分化缺陷和呈細(xì)胞凋亡增加的低增生性貧血[14]。國(guó)內(nèi)報(bào)道21例DBA，檢測(cè)到3例RPS19基因突變[15]。本組研究14例DBA中發(fā)現(xiàn)1例RPS19基因突變，為外顯子4的點(diǎn)突變；其為3歲女患兒，在3個(gè)月時(shí)診斷，長(zhǎng)期小劑量糖皮質(zhì)激素維持血紅蛋白100g/L左右，身材發(fā)育落后。但本組1例DBA患兒有類似疾病家族史和1例合并多種畸形并伴有智力落后的患兒，被認(rèn)為很有可能存在基因突變卻未檢出RPS19基因異常。家族性發(fā)生的DBA病例顯示常染色體顯性遺傳方式，檢測(cè)到的RPS19基因突變患兒的雙親未發(fā)現(xiàn)同樣異常。核糖體蛋白，尤其RPS19的基因突變與DBA的發(fā)病有密切關(guān)系，但50%的患者無(wú)核糖體基因異常，同時(shí)我們對(duì)純紅20例純紅再障進(jìn)行了RPL5、RPL11基因測(cè)序檢測(cè)，然而均未發(fā)現(xiàn)突變。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)RPS19突變可能與先天性純紅再障有關(guān)；獲得性純紅再障發(fā)病與RPS19、RPL5和RPL11基因異?？赡軣o(wú)關(guān)。目前關(guān)于DBA的病因和發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，除核糖體蛋白基因外，還有哪些基因異常是DBA的病因，該病的遺傳方式如何都是有待探討的問(wèn)題。獲得性純紅再障是否在某些基因異常基礎(chǔ)上發(fā)病，也有待進(jìn)一步探討。

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Clinical characteristics and RPS19, RPL5, RPL11 gene mutation of pure red cell aplasia

LIAOXue-lian1，JIANGSha-yi1，JIANGHui1，HEHai-long2，CHENLi-jun3，XIEXiao-tian4

(1. Dept. of Hematology/Oncology， Shanghai Children’s Hospital， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200062， China; 2. Dept. of Hematology， Suzhou Children’s Hospital; Suzhou 215001， Jiangsu Province， China;3. Dept. of Hematology， Shandong Children’s Hospital; Jinan 250021， Shandong Province， China;4. Dept. of Paediatrics， Tongji Hospital， Tongji University， Shanghai 200065， China)

Objective To investigate clinical features and RPS19， RPL5 and RPL11 gene mutations in patients with acquired pure red cell aplasia(PRCA) and congenital PRCA(Diamond-Blackfan anemia， DBA). Methods Twenty children with PRCA from multiple centers were enrolled， including 14 DBA and 6 acquired PRCA. The age of disease onset， peripheral blood counts， and responses to treatment were compared between these two groups. RPS19， RPL5 and RPL11 gene sequences were determined using the Sanger dideoxy chain termination method. Results Six out of 14 DBA patients(42.8%) presented combined congenital malformation. Compared with the acquired PRCA patients， DBA patients displayed a lower number of reticulocytes(P<0.05)， no differences in peripheral white blood cell(WBC)， hemoglobin(HB)， and platelet(PLT) counts. The efficacy of corticosteroids treatment for DBA was 78.6%， while that for acquired PRCA was 100.0% (P>0.05). RPS19 point mutations were detected in 1 DBA patient， and not in acquired PRCA patients. RPL5 and RPL11 point mutations were not detected in DBA or acquired PRCA. Conclusion Patients with DBA have lower reticulocyte counts than acquired PRCA patients. DBA might be associated with RPS19 gene mutation.

Diamond-Blackfan Anemia(DBA)； Pure Red Cell Aplasia(PRCA)； Gene Mutation； RPS19； RPL5； RPL11

10.16118/j.1008-0392.2015.06.007

2015-08-24

上海交通大學(xué)自然科學(xué)基金(13XJ10069)

廖雪蓮(1978—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail： liaoxl@shchilren.com.cn

蔣莎義.E-mail： jiangsy@shchildren.com.cn

R 725.5

A

1008-0392(2015)06-0036-04