樊志剛　劉芳

[摘 要] 目的：研究腫瘤壞死因子（TNF-α）預(yù)處理的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（HUMSC）血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)及其對(duì)心肌梗死大鼠心功能的影響。方法：實(shí)驗(yàn)組取第3代HUMSC用TNF-α（10 ng/mL）預(yù)處理24 h后，遷移黏附實(shí)驗(yàn)檢測其體外遷移黏附能力，Western blot檢測VCAM-1蛋白表達(dá)；對(duì)照組不用TNF-α處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組（注射TNF-α預(yù)處理HUMSC）和對(duì)照組（注射HUMSC），取第3代HUMSC移植于心肌梗死大鼠的心肌內(nèi)3周后，二維超聲心動(dòng)圖檢測大鼠左心室心功能。結(jié)果：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組體外遷移黏附力明顯增強(qiáng)（P<0.05）；黏附分子VCAM-1的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；左心室射血分?jǐn)?shù)明顯提高（P<0.05）。結(jié)論：移植TNF-α預(yù)處理的HUMSC更能明顯改善大鼠心功能，其機(jī)制可能與TNF-α提高HUMSC黏附分子VCAM-1的蛋白表達(dá)水平相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 腫瘤壞死因子-α；臍血間充質(zhì)干細(xì)胞；黏附分子

中圖分類號(hào)： R332 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)：2095-5200（2015）04-004-05

每年全球約有1700萬人死于心血管病，其中占總數(shù)1/2患者死于急性心肌梗死（AMI）[1]。過去30年中，MI病死率（30 d內(nèi)）雖然已降至10% ，但年病死率仍為20% 左右[2]。目前，MI治療方法以藥物、介入和外科手術(shù)為主，這些方法可解除血管阻塞，緩解心室重構(gòu)，延緩和改善心功能惡化及心律失常發(fā)生，但無法逆轉(zhuǎn)壞死心肌，使已梗死心肌細(xì)胞再生。而干細(xì)胞治療給人們帶來了新希望。

MSC具有多向分化潛能、支持和促進(jìn)造血干細(xì)胞植入、調(diào)節(jié)免疫以及分離、培養(yǎng)時(shí)操作簡便等特點(diǎn)[3]。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（Human Umbilical cord blood mesenchymal stem cells，HUMSC）是從臍帶組織中分離出來，較祖細(xì)胞更原始，有更強(qiáng)增殖分化能力[4]；免疫原性較為幼稚，不易觸發(fā)免疫反應(yīng)或引起移植物抗宿主??；較骨髓MSC有更大應(yīng)用潛能。

循環(huán)血液中干細(xì)胞歸巢到缺血組織中是組織修復(fù)第一步，干細(xì)胞歸巢第一步就是黏附于心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞[5]，因此提高移植干細(xì)胞向受損組織遷移及定植對(duì)提高干細(xì)胞治療效果具有重要價(jià)值。黏附分子廣泛存在于細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中，通過與受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)接觸，并參與細(xì)胞活化與遷移[6]。在炎癥、缺血性損傷及傷口愈合等過程中發(fā)揮重要作用。生理狀態(tài)下充質(zhì)干細(xì)胞少量表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1），而明顯表達(dá)細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule-1，ICAM）[7]。Segers等[8] 研究發(fā)現(xiàn)，VCAM-1對(duì)BMMSCs黏附于心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要作用，在加入VCAM-1抗體后可完全消除由腫瘤壞死因子 （tumor necrosisfactor，TNF-α）預(yù)處理增強(qiáng)MSC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附性，而加入ICAM-1抗體則MSC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力卻沒有明顯變化。所以本研究用采用TNF-α預(yù)處理HUMSC，通過遷移黏附能力、VCAM-1表達(dá)和左心室功能變化等檢測指標(biāo)，探討其對(duì)心肌梗死大鼠治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠20只，清潔級(jí)，220～250 g用于心肌梗死造模，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2 主要試劑和儀器

L-DMEM、胎牛血清（fetalbovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司；0.25%胰酶、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α購自美國Peprotech公司；PVDF膜購自美國Sigma公司；VCAM-1一抗購自美國Bioworld公司；β-actin、二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡Olympus BX41購自日本Olympus公司；二維多普勒超聲儀購自美國Phillips公司。

1.3 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)

臍血來自于鄭州市婦幼保健醫(yī)院產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)足月妊娠順產(chǎn)嬰兒，參照文獻(xiàn)[9]采用密度梯度離心法獲取HUMSC，將分離細(xì)胞以5×106/mL接種于含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞鑒定

將第3代HUMSC調(diào)整為1×106 /L 細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志測定。細(xì)胞分別與鼠抗人FITC-CD90、PE-CD86、FlTC-CD45，PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗體反應(yīng)，在4℃暗室中放置30min。以鼠抗人PE/FITC-IgG1為平行對(duì)照。數(shù)據(jù)用Cell Quest軟件處理。

1.5 體外遷移實(shí)驗(yàn)

將第3代HUMSC濃度調(diào)整為5×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于8 μm孔徑24孔transwell小室上層，下層加入500μL含2%FBSL-DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組下層培養(yǎng)液中加入TNF-α使得其終濃度為10 ng/mL，對(duì)照組加入等體積PBS，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后取出小室，用熒光倒置顯微鏡下觀察并隨即選取6個(gè)視野拍照后計(jì)數(shù)遷移至膜下表面細(xì)胞數(shù)目。

1.6 體外黏附實(shí)驗(yàn)

將第3代HUMSC長至80%融合時(shí)，實(shí)驗(yàn)組加入TNF-α（10 ng/mL）處理，培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL細(xì)胞懸液經(jīng)1200 r/min離心3min后重懸于250μLL-DMED中，然后接種于膠原包被24孔板，靜置15 min后，用PBS洗兩遍，去除未貼壁干細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野拍照后計(jì)數(shù)。

1.7 Western blot檢測黏附分子蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組加入TNF-α（10 ng/mL）處理，培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入上樣緩沖液后100℃水浴變性5 min，10SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液封閉2 h，加一抗孵育12h，HRP標(biāo)記二抗孵育2 h。洗膜后將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液（ECL）涂于PVDF膜上，曝光并采集圖像。Ge1-Pro analyzer 4軟件分析蛋白條帶，以β-actin表達(dá)量作為參照。

1.8 大鼠心肌梗死模型制備和細(xì)胞移植

麻醉大鼠后，接心電監(jiān)護(hù)、氣管插管并接上小動(dòng)物呼吸肌，于心前區(qū)肋間隙進(jìn)入胸腔并刺破心包，在與左心耳交界處下方0.2cm處縫扎左前降支動(dòng)脈，可見心電監(jiān)護(hù)ST段顯著抬高。術(shù)后關(guān)胸常規(guī)肌注30萬U青霉素，心肌梗死模型復(fù)制成功后1周，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只。對(duì)照組大鼠梗死局部心肌內(nèi)注射HUMSC100μL（1×105個(gè)），實(shí)驗(yàn)組大鼠梗死局部心肌內(nèi)注射第3代TNF-α預(yù)處理HUMSC100μL（1×105個(gè)），所有動(dòng)物隨后關(guān)胸并給予抗生素處理。

1.9 超聲心動(dòng)圖檢測大鼠心功能

移植后3周，大鼠麻醉后固定于鼠板上，二維多普勒超聲儀檢測大鼠左心室舒張末內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEd）、左心室收縮末內(nèi)徑（left ventricular end- systolic dimension，LVDs），按照公式：LVEF=[（ LVDd）3-（ LVDs）3]/ （ LVDd）3×100%計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GrahPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)

倒置顯微鏡下可見，培養(yǎng)初期胞體小且呈圓形（圖1A），2d以后逐漸變?yōu)闄E圓、胞體變大（圖1B），7d（第3代）后向兩級(jí)伸出凸起為長梭形（圖1C）。

2.2 細(xì)胞檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示CD34、CD45陽性率不足10%，提示大部分人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞不是造血干細(xì)胞。CD19和CD86陽性率少于10%，CD90、CD105陽性率高于70%，主要組織相容性復(fù)合體HLA-ABC陽性率為90% 以上，HLA-DR陽性率低于5%，結(jié)果提示人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表型相似。

2.3 體外遷移能力

結(jié)果表明與TNF-α共培養(yǎng)24h后，TNF-α處理組從小室表面遷移到小室下表面細(xì)胞數(shù)目（26.4±2.8）明顯多于PBS組（6.9±1.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明TNF-α可以增強(qiáng)干細(xì)胞體外遷移能力。（見圖2a/b）

2.4 體外黏附能力

結(jié)果表明與TNF-α共培養(yǎng)24h后，TNF-α處理組黏附于培養(yǎng)板細(xì)胞數(shù)目（41.2±3.6）明顯高于PBS組（7.8±1.3），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明TNF-α可以顯著增強(qiáng)干細(xì)胞黏附能力。（見圖3a/b）

2.5 黏附分子VCAM-1表達(dá)

用Western blot法檢測轉(zhuǎn)移至膜上蛋白含量，結(jié)果表明，PBS組VCAM-1表達(dá)較低，TNF-α處理組能顯著誘導(dǎo)VCAM-1蛋白合成，約為對(duì)照組3倍，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)意義（見圖4）。

2.6 TNF-α預(yù)處理HUMSC對(duì)大鼠心功能影響

移植后3周，對(duì)照組（HUMSC）有2只大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)組（TNF-α預(yù)處理HUMSC）有1只大鼠死亡。LVDd、LVDs、LVEF結(jié)果見表1，多普勒超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組LVEF明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。說明經(jīng)TNF-α預(yù)處理HUMSC移植可以明顯改善心功能。

3 討論

MSC具有較強(qiáng)擴(kuò)增能力，可分化成心肌樣細(xì)胞和有助于血管形成血管平滑肌細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，能參與心肌缺血引起心肌重構(gòu)和血管再生，達(dá)到替代損傷心肌細(xì)胞，改善心功能目[10]。由于MSC缺少主要組織相容性復(fù)合體II ，可參與免疫調(diào)控但具免疫豁免性，增強(qiáng)了異體細(xì)胞移植安全性，因此最有可能發(fā)展成標(biāo)準(zhǔn)化治療，從而滿足大部分人治療需求[11]。很多研究者認(rèn)為，干細(xì)胞可能是通過旁分泌而不是替代梗死心肌來發(fā)揮改善心功能作用[12-13]，目前已發(fā)現(xiàn)多種干細(xì)胞因子以旁分泌產(chǎn)生作用[14-15]。

臍血中含有豐富間充質(zhì)干細(xì)胞[16]，是近年發(fā)現(xiàn)具有與骨髓干細(xì)胞細(xì)胞（BMMSC）相同多向分化潛能原始祖細(xì)胞，和其他來源干細(xì)胞相比，臍血來源廣泛，臍血中淋巴細(xì)胞免疫功能不夠成熟，免疫原性較弱，移植物抗宿主病發(fā)生率較低[17-18]；HUMSC易于分離[19-20]為一種新可靠干細(xì)胞來源，在適當(dāng)條件下具有向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等組織細(xì)胞多項(xiàng)分化潛能[21]。

目前，已有多種干細(xì)胞應(yīng)用于MI臨床治療研究[22-23]，但HUMSC移植治療MI還比較少。干細(xì)胞移植治療主要困難之一是移植干細(xì)胞只有很少一部分能存活和植入心肌中。所以如何提高干細(xì)胞移植存活率成為研究者首當(dāng)其沖問題。Luo 等[24-25]研究發(fā)現(xiàn)在梗死區(qū)邊緣區(qū)注入高表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）干細(xì)胞，可以減少梗死區(qū)面積，增加梗死區(qū)周圍心肌血管生成，促進(jìn)冠脈結(jié)扎實(shí)驗(yàn)中心臟功能恢復(fù)。Ries 等[26]研究發(fā)現(xiàn)提高BMMSC基質(zhì)金屬酶表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞趨化和遷移。

心肌梗死后會(huì)釋放大量炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)一方面可以促進(jìn)組織修復(fù)和增強(qiáng)心肌對(duì)缺血適應(yīng)，但另一方面這些介質(zhì)也可以促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡和加快基質(zhì)降解進(jìn)而抑制和減低心功能[27-29]。以前研究重視干細(xì)胞移植后如何降低炎癥因子表達(dá)，但新近有研究[30-32]證實(shí)用炎癥因子處理過干細(xì)胞移植能明顯改善心功能，促進(jìn)心肌功能恢復(fù)。Herrmann等[33]研究發(fā)現(xiàn)，用TGF-a預(yù)處理24h BMMSC移植可以增加VEGF表達(dá)，進(jìn)一步保護(hù)大鼠心肌和減少壞死區(qū)域面積。

本研究之所以選擇TNF-α濃度為10 ng/mL是因?yàn)檫@一濃度刺激可以激活干細(xì)胞旁分泌而不改變其表面活性物質(zhì)[34]。有研究[35]顯示移植MSC可以促進(jìn)梗死區(qū)炎性因子如TNF-α、白介素-6和轉(zhuǎn)化生長因子等釋放，這些因子又對(duì)細(xì)胞旁分泌起重要作用。因此研究移植后干細(xì)胞對(duì)炎性環(huán)境應(yīng)答對(duì)提高其存活率和改善心功能有更重要價(jià)值。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Psaltis PJ，Zannettino AC，Worthley SG，et a1.Concise review：mesenchymal stromal cells：potential for cardiovascular repair.Stem Ceils[J].2008，26（1）：2201-2210.

[2] Przybyt E，Harmsen MC.Mesenchymal stem cells：promising for m yocardial regeneration Curr Stem Cell Res Ther[J].2013，8（2）：270-277.

[3] Ballard VI .Stem ceils for heart failure in the aging heart[J].Hear Fail Rev，20l0，15（1）：447-456.

[4] Hodgkinsol CP，Gomez JA，Mrotsou M，et a1.Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J].Hum Gene Ther，2010，21（2）：1513-1526.

[5] Hodgkinson CP，Gomez JA，Rotsou M.Genetic engineering of mesenchymal stem cells and its application in human disease therapy[J].Hum Gene Ther，2010，21（2）：1513-1526.

[6] Miettinen JA，Salonen RJ，Ylitalo K，et a1.The effect of bone marrow microenvironment on the functional properties of thetherapeutic bone marrow derived cells in patients with acute myocardial infarction[J].J Transl Med，2012，10（1）：66.

[7] Hyun Y M ，Chung H L，McGrath J L，et a1.Activated integrin VLA 4 localizes to the lamellipodia and mediates T cell migrationon VCAM-1[J].J Immunol，2009，183（1）：359-369.

[8] Segers V F，Van-Riet Andries LJ， et al.Mesenchymal stem cell adhesion to cardiac microvascular endothelium：activators and mechanisms[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290（4）：1370-7.

[9] Pucilowska J，Puzerey PA，Karlo JC，et a1.Disrupted erk signaling during cortical development leads to abnormal progenitor proliferation， neuronal and network excitability and behavior， modeling human neuro-cardio-facial-cutaneous and related syndromes.[J]. J Neurosci，2012，32（25）：8663-8677.

[10] Herrmann JL，Abarbanell AM，Weil BR，et a1.Optizing stem cell function for the treatment of ischemic heart disease[J].Surg Res，2011，166：138-145.

[11] Hoover Plow J，Gong Y.Challenges for heart disease stem cell therapy[J].Vasc Health Risk Manag，2012，8（2）：99 -113.

[12] Ballard VL.Stem cells for heart failure in the aging heart[J].Heart Fail Rev，2010，l5（1）：447-456.

[13] Wen J，Zhang JQ，Wei H，et a1.SDF 1q and CXCR4 as therapeutic targets in cardiovascular disease[J].Am J Cardiovasc Dis，2012，2（2）：20-28.

[14] Fedak PW.Paracrine effects of cell transplantati0n： modifying ventricular rem odeling in the failing heart[J].Sen Thorac Cardiovase Surg，2008，20（1）：87-93.

[15] Herrmann JL，Abarbanell AM，Weil BR，et a1.Optizing stem cell function for the treatment of ischemic heart disease[J].J Surg Res，2011，166（3）：138-145.

[16] Biuqstud K B， Tenq Y G，Redmond D E，et a1.Human neural stem cells migrate along the nigrotriata1 pathway in a primatemodel of Parkinsons disease[J].ExpNeurol，2008，211（2）：362-369.

[17] Sanders RD，Xu J，Shu Y，et a1. Dexmedetomidine attenuates isoflurane—induced neurocoguitive impairment in neonatal rats [J].Anesthesiology，2009，110（5）：1077-1085.

[18] Sande RD，Sun P，Pate1 S，et a1. Dexmedetomidine provides cortical neuroprotection： impact on anaesthetic‐induced neuroapoptosis in the rat developing brain[J].Acta Anaesthesiol Scand， 2010，54（6）：710-716.

[19] Pucilowska J，Puzerey PA，Karlo JC，et a1.Disrupted erk signaling during cortical development leads to abnormal progenitor proliferation， neuronal and network excitability and behavior， modeling human neuro-cardio-facial-cutaneous and related syndromes.[J]. J Neurosci，2012，32（25）：8663-8677.

[20] Biuqstud K B，Tenq Y G，Redmond D E，et a1.Human neural stem cells migrate along the nigrotriata1 pathway in a primatemodel of Parkinsons disease[J].ExpNeurol，2008，211（2）：362-369.

[21] 王蒙 ，楊媛.人臍血源性MSCs成骨誘導(dǎo)分化后對(duì)DCs免疫抑制研究[J]. 免疫學(xué)雜志，2012，28（11）：959-963.

[22] Nabel E G，Brannwald E.A tale of coronary artery disease and myocardial infarction[J].N Engl J Med，2012，366（1）：54-63.

[23] Nasef A，F(xiàn)ouillard L，Ashammakhi N.Immunomodulatory effect of mesenchymal stromal cells：possible mechanisms[J].RegenMed，2008，3（4）：531-46.

[24] Luo Y，Wang Y，Poyntcr J A，et a1. Pretrcating mesenchymal stem cels with interleukln-1β and transforming growth factor– β psynergistically increases vascular endothelial growth factor production and improves mesenehymal stem cell--mediated myocardial protection after acute ischemia[J].Surgery，2012，151（3）：353-63.

[25] Ries C，Egea V，Karow M，et a1.MMP-2，MT1，MMP，and TIMP-2 are essential forthe invasive capacity of human mesenehymalstem cells：differential regulation by inflammatory cytokines [J].Blood，2007，109（9）：4055-63.

[26] Nian M，Lee P，Khaper N，et a1.Inflammatory cytokines and postmyoeardial infarction remodeling[J].Circ Res，2004，94（12）：1543-1553.

[27] Egea V，yon Baumgarten L，Schichor C，et a1.TNF-13t respecifies human mesenchymal stem cells to a neural fate an d promotes migration toward experimental glioma[J].Cell Death Differ，2011，18（5）：853-863.

[28] Tit，XM，Peyton KJ，Shebib AR，et a1.Activation of AMPK stimulates heme oxygenase-1 gene expression and human endothelial cell survival[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，300（3）：84-93.

[29] Jazwa A，Stepniewski J，Zamykal M，et a1.Pre-eruptivehypoxia regulated HO-1 gene therapy improves postischaemic limb perfusion and tissue regeneration in mice [J].Cardiovasc Res，2013，97（4）：115-124.

[30] Yaghoubi SS，Campbell DO，Radu CG，et a1.Positron emission tomography reporter genes and reporter probes：gene and cell therapy applications[J].Theranostics，2012，2（1）：374 -391.

[31] Wu ML，Ho YC，Lin CY，et a1.Heme oxygenase-1 in inflammation and cardiovascular disease [J].Am J Cardio-vasc Dis，2011，1（2）：150-158.

[32] Terrovitis JV，Smith RR，Marb6n E.Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart[J].Circ Res，2010，106（3）：479-494.

[33] Henmann J L，Abarbanell A M，Wang Y，et al.Transforming growth faetor etenhances stem cell mediated postischemic myocardial protection[J].Ann Thorae surg，2011，92（5）：1719-1725

[34] Xiao Q，Wang sK，Tian H，et al. INF-otincreases bonemal Tow mesenehymalstem cell migration to ischemic tissues[J].Cell Biochcm Biophys，2012，62（3）：409-414.

[35] Armifi6n A，Gandfa C，Garcia Verdugo JM，eta1.Mesenehymal stem cells provide better results than hematopoietic precumom for the treatment of myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol，2010，55（2）：2244-2253.