黃爍丹 占偉 鄒婕 莊宇嫦 熊蓉 朱莎莎 張華能 欒國彥

臨床研究論著

濾紙干血斑DNA自動化提取及其在地中海貧血基因診斷中的應(yīng)用

黃爍丹 占偉 鄒婕 莊宇嫦 熊蓉 朱莎莎 張華能 欒國彥

目的研究濾紙干血斑(DBS)DNA 的自動化提取方法及其在地中海貧血(地貧)基因診斷中的應(yīng)用。方法將276份經(jīng)靜脈血標(biāo)本基因檢測確診為地貧的孕婦外周血標(biāo)本按照研究需要分別制成240份合格、18份滲透不良和18份重復(fù)滴血濾紙干血斑標(biāo)本，并模擬不同的運輸和儲存條件。使用 Lab-Aid 820 核酸提取儀對濾紙干血斑進(jìn)行DNA提取，考察不同的起始血斑用量檢測的準(zhǔn)確度，對提取的DNA進(jìn)行濃度和純度分析，并分別使用熒光PCR熔解曲線法和PCR聯(lián)合膜雜交法對DNA進(jìn)行地貧基因檢測。結(jié)果276份濾紙干血斑標(biāo)本提取的DNA濃度9.85～29.56 ng/μl，純度1.63～1.95，均能滿足試劑盒檢測要求，其中2種基因型檢測方法的檢測結(jié)果100%符合，2種方法均檢出地貧基因突變IVS-Ⅱ-654 (C>T)、-28(A>G)、CD17 (A>T)、CD26 (G>A)、CD41/42 (-TTCT)、--αSEA、-α3.7、--α4.2、αCSα，所有結(jié)果均與使用靜脈血提取DNA作為標(biāo)本的檢測結(jié)果100% 符合，覆蓋了目前臨床上常見的各種基因型。結(jié)論DBS標(biāo)本對運輸、保存要求較低，結(jié)合自動化核酸提取儀提取DNA，操作簡單、提取結(jié)果穩(wěn)定，可用于臨床篩查地貧基因。

干血斑；地中海貧血；DNA 提?。粺晒釶CR 熔解曲線法

地中海貧血(地貧)即珠蛋白生成障礙性貧血，為一種常染色體隱性遺傳病，是由珠蛋白基因的缺失或者點突變，使珠蛋白肽鏈合成障礙或速率降低、血紅蛋白產(chǎn)量減少所引起的一組常染色體隱性遺傳性溶血性貧血[1-2]。該病是我國南方常見的遺傳性貧血病，在我國廣東、廣西、四川多見，長江以南各省區(qū)有散發(fā)病例[3]。目前對地貧尚無有效的治療方法，因此通過婚檢及產(chǎn)前篩查等途徑進(jìn)行大規(guī)模的人群篩查和診斷，發(fā)現(xiàn)攜帶地貧基因的夫妻，在妊娠早期進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，對產(chǎn)前診斷為中重型地貧的胎兒進(jìn)行終止妊娠，是防止中重型地貧兒出生、提高出生人口素質(zhì)的有效措施。目前，裂口PCR、反向點雜交、實時熒光PCR熔解曲線法等相關(guān)技術(shù)已成為當(dāng)下最普遍的地貧診斷方法[4]?，F(xiàn)階段，臨床用于地貧基因診斷的標(biāo)本主要來自受檢者的靜脈血。但是，這種方法在標(biāo)本采集、分離、保存和運輸過程中不可避免地會遇到一些難題。此外，受生物危險品運輸限制，全血需專人冷鏈運輸。隨著我國產(chǎn)前篩查、新生兒篩查力度的不斷增強，特別是當(dāng)篩查范圍擴(kuò)大到一些地域偏遠(yuǎn)、醫(yī)療條件相對落后的地區(qū)時，應(yīng)用濾紙干血斑(DBS)對于患者標(biāo)本采集、保存和運輸就更為有利[5]。從DBS標(biāo)本中提取到符合應(yīng)用要求的 DNA，則是各種診斷方法有效開展的必要前提。本研究旨在尋找一種有效、穩(wěn)定、快速的DBS DNA 自動化提取方法并將其應(yīng)用在地貧基因診斷中，現(xiàn)報告如下。

材料和方法

一、標(biāo)本來源

收集2014年1～5月在梅州市婦幼保健院診治、經(jīng)靜脈血基因檢測確診為地貧的276例孕婦外周血標(biāo)本。

二、主要試劑和儀器

Whatman 903號濾紙(Whatman，英國)，Lab-Aid 核酸(DNA)分離試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)，地貧基因熒光PCR熔解曲線法檢測試劑盒(廈門致善生物科技有限公司)，α-和β-地貧基因檢測試劑盒(PCR+膜雜交法)(廣東凱普生物科技股份有限公司)，Lab-Aid 820核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)，SLAN96s四色熒光PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司，中國)，Nanodrop 2000 分光光度計(Thermo Scientific，美國)。

三、方法

1.DBS標(biāo)本的制備

按研究的需要分別制成240份合格、18份滲透不良、18份重復(fù)滴血的DBS標(biāo)本。標(biāo)本采集使用Whatman 903號濾紙，合格的標(biāo)本是指在每張濾紙上滴3滴血(40～50 μl)，血斑直徑>8 mm，滲透充分。滲透不良標(biāo)本制備時取25 μl血液，平涂于濾紙采樣圈上，濾紙背面只有少量血滲透過去。重復(fù)滴血標(biāo)本制備時取25 μl血液標(biāo)本，滴于采樣圈中，再取25 μl標(biāo)本重復(fù)滴于采樣圈的同一位置。之后室溫條件下自然干燥4 h，獨立包裝并密封即制成DBS標(biāo)本。

2.DBS標(biāo)本的保存和處理

所采集的276例標(biāo)本，按表1的條件模擬采集、運輸、保存和極端情況下可能出現(xiàn)的各種情形，進(jìn)行血斑標(biāo)本運輸及保存條件研究。其中，4℃ 3 d、室溫3 d是標(biāo)本運輸、保存過程中最常用的條件，在血斑上打下8片直徑3 mm的血片是進(jìn)行DBS核酸提取的常規(guī)用量。

3.標(biāo)本的DNA提取

DBS標(biāo)本：分別使用打孔鉗從血斑標(biāo)本采樣圈中打下8～12片直徑3 mm的血片，收集在1.5 ml離心管中。每份標(biāo)本取用后，均用酒精棉擦拭并灼燒打孔鉗頭部，避免交叉污染。提取步驟：向裝有血片的離心管中加入500 μl裂解液，56℃孵育1 h。將經(jīng)過孵育處理的液體加入DNA分離試劑盒試劑條的第一個孔位中，所有標(biāo)本加入完成后，將放置提取試劑條的載架放入Lab-Aid 820核酸提取儀提取操作室中，選擇血斑標(biāo)本提取程序，儀器自動完成提取。使用Nanodrop 2000 分光光度計進(jìn)行吸光值檢測，計算DNA濃度和純度。然后使用熒光PCR熔解曲線法和PCR+膜雜交法2種不同檢測方法對應(yīng)試劑盒進(jìn)行地貧基因檢測，按照說明書進(jìn)行操作。

表1 DBS標(biāo)本摸擬采集、運輸和保存條件設(shè)計

靜脈血標(biāo)本：取200 μl混勻的靜脈血標(biāo)本加入Lab-Aid核酸(DNA)分離試劑盒試劑條的第一個孔位中，所有標(biāo)本加入完成后，將放置提取試劑條的載架放入Lab-Aid 820核酸提取儀提取操作室中，選擇血液標(biāo)本提取程序，儀器自動完成提取。分別使用熒光PCR熔解曲線法和PCR+膜雜交法兩種不同檢測方法對應(yīng)試劑盒進(jìn)行地貧基因檢測，按照說明書進(jìn)行操作。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以中位數(shù)(上、下四分位數(shù))表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，如各組總體出現(xiàn)差異，再行兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、DBSDNA吸光值檢測結(jié)果

所有276份的DBS標(biāo)本提取的濃度及純度均在正常范圍內(nèi)。其中，1組標(biāo)本提取的DNA濃度明顯高于2～10組(H=56.24，P<0.001)；與2、3、6組比較，4、5組標(biāo)本提取的DNA濃度稍低(P<0.05)，滲透不良的9組DBS標(biāo)本DNA濃度明顯偏低(P<0.001)，重復(fù)滴血的10組DBS標(biāo)本DNA濃度和2～8組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具體吸光值結(jié)果見表2。

二、地貧基因檢測結(jié)果

所有276份的DBS DNA和靜脈血DNA標(biāo)本中，2種檢測試劑盒均正常檢出276例陽性突變，分別為IVS-Ⅱ-654 (C>T)66例、-28(A>G)27例、CD17 (A>T)15例、CD26 (G>A)9例、CD41/42(-TTCT)45例、--αSEA75例、-α3.715例、--α4.218例、αCSα 6例，檢測結(jié)果覆蓋了目前市面上各種常見地貧基因型；4組檢出結(jié)果符合率達(dá)100%。

表2 DBS標(biāo)本DNA吸光值檢測結(jié)果[中位數(shù)(上、下四分位數(shù))]

討 論

地貧是我國南方常見的常染色體隱性遺傳性疾病，據(jù)統(tǒng)計廣東省β-地貧攜帶率為1.83%～3.36%。近年我國地貧篩查力度逐淅加強，用于進(jìn)行基因檢測的標(biāo)本范圍從常規(guī)的抗凝全血發(fā)展到孕早期胎兒絨毛、羊水、臍帶血、孕婦外周血血漿中胎兒游離DNA及DBS[6-7]。本研究模擬各種檢測時可能出現(xiàn)的條件，設(shè)計了對不同用量、不同保存條件、不同運輸條件(模擬)、不同狀況的DBS標(biāo)本進(jìn)行DNA 提取并應(yīng)用于后續(xù)基因檢測。結(jié)果顯示，采樣點多的DBS標(biāo)本所提取的DNA濃度較高，在不同保存及運輸條件下的正常DBS標(biāo)本，所提取的DNA均可以滿足常規(guī)地貧檢測試劑盒的使用要求。這可能是DBS標(biāo)本中血斑已經(jīng)干燥、且獨立包裝及密封儲存，受溫度及儲存時間的影響較小有關(guān)。針對滲透不良及重復(fù)滴血血斑的檢測結(jié)果亦表明，此類血斑在常規(guī)保存、運輸后提取的核酸亦可滿足常規(guī)地貧基因檢測要求。結(jié)果表明，DBS標(biāo)本克服了抗凝全血在采集、運輸、保存等方面存在的不便。本研究中各組條件提取的DNA吸光值檢測及基因檢測結(jié)果均正常，證明該方法可以應(yīng)用于對某地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模的地貧防控工作。而且在新生兒篩查方面，用于制作干血斑所需的血液用量少，且從新生兒足跟取樣，把對新生兒的有創(chuàng)傷害降到了最小。

隨著地貧分子診斷技術(shù)朝著自動化和低成本的方向發(fā)展，簡單、快速、穩(wěn)定的核酸產(chǎn)物制備方法備受青睞[5]。本研究選用了Lab-Aid 820核酸提取儀進(jìn)行276份血斑標(biāo)本DNA的提取。相比傳統(tǒng)的Chelex100法，Lab-Aid 820核酸提取儀無需在提取過程中進(jìn)行長時間孵育，且提取產(chǎn)物中無雜質(zhì)殘留，對后續(xù)PCR反應(yīng)基本無抑制；而相比目前使用較多的離心柱法，Lab-Aid 820核酸提取儀使用預(yù)封裝的試劑盒，加入標(biāo)本后，儀器僅需一鍵操作即可進(jìn)行提取，使用更便捷，省去了大量的人力成本，且能有效的避免人工操作誤差。Lab-Aid 820核酸提取儀可以一次性處理20份標(biāo)本，儀器提取運行時間為35 min左右。在本研究中，使用Lab-Aid 820 核酸提取儀提取276份DBS標(biāo)本共進(jìn)行了14次操作，從準(zhǔn)備血斑標(biāo)本、標(biāo)本消化預(yù)處理(60 min)到儀器完成提取，單次提取所耗時間約110 min。提取的DBS DNA分別應(yīng)用于PCR+膜雜交法及實時熒光PCR熔解曲線法進(jìn)行地貧檢測，均能較好的滿足試劑盒的檢測要求。2種試劑盒都正常檢測出臨床上常見的各種地貧基因型。

綜上所述，DBS標(biāo)本對運輸、保存要求較低，結(jié)合自動化血斑標(biāo)本DNA提取，操作簡單、提取結(jié)果穩(wěn)定，有利于大范圍開展地貧防控工作。

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AutomaticDNAextractionfromdriedbloodspotsonfilterpaperanditsapplicationinthediagnosisofthalassemia

HuangShuodan，ZhanWei，ZouJie，ZhuangYuchang,XiongRong,ZhuShasha,ZhangHuaneng,LuanGuoyan.

GeneticDiseasePreventionCenter,MeizhouMaternalandChildHealthHospital,Meizhou514012,China

ObjectiveTo study the method of automatic DNA extraction from dried blood spots (DBS) on filter pater and its application in the molecular diagnosis of thalassemia.MethodsPeripheral blood specimens were collected from 276 pregnant women who were diagnosed with thalassemia through molecular diagnostic procedures using venous blood samples. The 276 peripheral blood samples were used to prepare 240 standard DBS specimens, 18 DBS specimens with incomplete blood penetration, and 18 DBS specimens with repeated blood blotting, according to the study protocol. Different transportation and storage conditions were simulated. DNA was extracted from the DBS onto filter paper with the Lab-Aid 820 Nucleic Acid Extraction System. The concentration and purity of the extracted DNA were analyzed with consideration of the different initial amounts of blood used for the preparation of DBS. Fluorescence PCR melting curve analysis and the PCR-based reverse dot-blot method were then used to detect the gene mutations responsible for thalassemia in the patients.ResultsThe concentrations of the DNA extracted from the 276 DBS samples ranged from 9.85 ng/μl to 29.56 ng/μl, with a purity of 1.63～1.95, and met the requirements of the diagnostic kits. The results from the two genotyping methods were 100% consistent, and both methods detected gene mutations present in the common genotypes that are clinically associated with thalassemia, including IVS-Ⅱ-654 (C>T), -28 (A>G), CD17 (A>T), CD26 (G>A), CD41/42 (-TTCT), --αSEA, -α3.7, --α4.2, and αCSα. The genotyping results of the 276 DBS samples were completely consistent with the results from the assay in which DNA was directly extracted from venous blood samples.ConclusionsDBS specimens do not require stringent conditions for transportation and storage. Automatic nucleic acid extraction and purification from DBS samples provides a quick, simple, and reliable method and is suitable for clinical screening of the gene mutations associated with thalassemia.

Dried blood spot; Thalassemia; DNA extraction; Fluorescence PCR melting curve analysis

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.008

梅州市科技計劃項目(2014B112)

514012 梅州，廣東梅州市婦幼保健院遺傳病防治中心(黃爍丹，鄒婕，莊宇嫦，熊蓉)；361101 廈門，福建廈門致善生物科技有限公司研發(fā)部(占偉，朱莎莎，張華能，欒國彥)

2015-01-20) (本文編輯：林燕薇)