朱斌 周堅(jiān) 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

基礎(chǔ)研究論著

正常產(chǎn)婦羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜分析的研究

朱斌 周堅(jiān) 陳芳 黎麗紅 葉志海 夏魯全

目的比對(duì)羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，尋找羊水特異性表達(dá)蛋白，為產(chǎn)科學(xué)的臨床研究提供分子依據(jù)。方法應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用4種不同原理的蛋白芯片檢測了12名正常足月產(chǎn)婦的羊水、血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜。結(jié)果羊水和血漿標(biāo)本分別測得蛋白信號(hào)(信噪比大于3)150個(gè)和250個(gè)。4種芯片檢出羊水特異性蛋白30個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為11 198、12705 Da的蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。結(jié)論羊水中存在特異性表達(dá)蛋白，其在妊娠相關(guān)生理、病理學(xué)中可能起重要作用。

羊水；血漿；蛋白質(zhì)指紋圖譜

羊水對(duì)于胎兒的發(fā)育至關(guān)重要，羊水中蛋白可能與妊娠相關(guān)性疾病發(fā)生有關(guān)[1]。羊水和孕婦血漿中的蛋白質(zhì)譜研究是尋找標(biāo)志物的重要途徑。表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)是隨著蛋白組學(xué)興起而出現(xiàn)的新技術(shù)，是一種基于蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)指紋圖譜分析平臺(tái)[2-7]。為尋找羊水特異性標(biāo)志蛋白，本研究采用SELDI-TOF-MS分析12例正常足月產(chǎn)婦的羊水和血漿蛋白質(zhì)組學(xué)，繪制并比對(duì)羊水和血漿蛋白質(zhì)指紋圖譜，旨在為產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域的研究提供可能的分子依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

選擇產(chǎn)檢正常、足月?lián)衿谛衅蕦m產(chǎn)的12例產(chǎn)婦為研究對(duì)象。術(shù)中行羊膜腔穿刺獲得羊水標(biāo)本，同時(shí)靜脈穿刺采集靜脈血5 ml，肝素抗凝，分離血漿后與羊水標(biāo)本置-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

二、主要儀器與試劑

采用PBSⅡc型SELD1-TOF-MS質(zhì)譜儀，WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、50反相型和Goldchip型蛋白芯片均為美國Liphergen公司產(chǎn)品，實(shí)驗(yàn)用水和試劑全部采用美國Sigma公司產(chǎn)品。

三、方法

血漿和羊水標(biāo)本均采用相同的實(shí)驗(yàn)方法，共完成12對(duì)樣品的檢測。為保證檢測的完整性和全面性，使樣品中不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)均被吸附而可檢測，本研究采用4種不同原理的蛋白芯片，即WCX2離子交換型、IMC3金屬螯合型、H50反相型和Goldchip型蛋白芯片，均嚴(yán)格按照芯片說明書操作，檢測相對(duì)分子質(zhì)量范圍1 000～180 000 Da。檢測獲得的血漿和羊水的蛋白質(zhì)指紋圖譜用Ciphergen Protein Chip軟件校正分子量、總離子強(qiáng)度、篩選和標(biāo)記信號(hào)，根據(jù)各信號(hào)的信息進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析[8-9]。

結(jié) 果

一、羊水特異性表達(dá)蛋白質(zhì)指標(biāo)圖譜及分子量

羊水和血漿標(biāo)本分別測得蛋白信號(hào)(信噪比大于3)150個(gè)和250個(gè)。4種芯片檢出羊水特異性的蛋白共計(jì)30個(gè)(圖1)。其中，相對(duì)分子質(zhì)量為11 198、12 705 Da的2種蛋白是比較確定的羊水特異性蛋白。

圖1 4種蛋白芯片測得的羊水特異性表達(dá)蛋白質(zhì)結(jié)果

上方：血清檢測結(jié)果；下方：羊水檢測結(jié)果；A～E：WCXZ交換型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對(duì)分子質(zhì)量依次分別為3 720、3 737、3 925、5 392、2 432、5 518、5 605、5 810、5 880、7 362、7 475、7 931、9 972、10 108、11 022、11 062、11 198、11 953、12 705、14 704、14 918、17 118、17 453 Da；F、G：IMC3金屬螯合型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對(duì)分子質(zhì)量依次分別為3 449、10 839、11 204、11 307、12 693 Da；H、I：H50反相型芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對(duì)分子質(zhì)量依次分別為7 524、7 975 Da；J：GoldChip金芯片結(jié)果，所標(biāo)注的相對(duì)分子質(zhì)量依次分別為10 893、11 780、14 733 Da

二、4種芯片在羊水特異性蛋白的檢測結(jié)果

30種羊水特異性蛋白中，WCX2交換型芯片檢出38種(95%)，IMC3金屬螯合型芯片檢出12種(30%)，H50反相芯片檢出11種(28%)，GoldChip檢出9種(23%)。

表1 4種芯片檢測結(jié)果的比較

注： +，僅存在羊水中；+-，僅存在羊水標(biāo)本中且并非12份羊水標(biāo)本中均有；-，羊水和血漿樣品均存在；×，未檢測到；由于使用H50芯片和GoldChip金芯片做檢測時(shí)，樣品沒有用尿素做預(yù)處理，同一個(gè)蛋白在H50芯片和GoldChip芯片上檢測到的分子量較在WCX2和IMC3芯片上檢測到的相對(duì)分子質(zhì)量大40～60 Da，本表相對(duì)分子質(zhì)量以WCX2和IMC3上測得的為準(zhǔn)。

討 論

根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)的原理，蛋白信號(hào)在橫軸上的位置及強(qiáng)度分別與蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及蛋白含量有著對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，蛋白芯片上出現(xiàn)蛋白信號(hào)即說明存在相應(yīng)分子蛋白，并且可以判斷該蛋白的含量。由此，我們判斷某個(gè)信號(hào)是否具羊水特異性的標(biāo)準(zhǔn)是：羊水中的信號(hào)強(qiáng)度與血清中的信號(hào)強(qiáng)度比值大于10。本研究在羊水中測得蛋白信號(hào)約150個(gè)，在血清中測得蛋白信號(hào)約250個(gè)。此外，本研究中所用的4種蛋白芯片分別依據(jù)蛋白質(zhì)的4種不同屬性進(jìn)行檢測，故任一芯片上出現(xiàn)羊水特異性信號(hào)即認(rèn)為此信號(hào)對(duì)應(yīng)的蛋白是羊水特異性蛋白。通過綜合分析4種類型芯片的蛋白信號(hào)結(jié)果，本研究最后認(rèn)定在4種類型芯片上表現(xiàn)出羊水特異性的蛋白共計(jì)30個(gè)，其相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在7 000～18 000 Da。

同一蛋白在不同類型芯片上可有不同的差異，這是由蛋白自身的性質(zhì)和在標(biāo)本中的含量決定的，譬如11 953、14 704、14 918 Da蛋白在WCX2芯片上表現(xiàn)出有無的差異，在IMC3芯片上表現(xiàn)不出有無的差異，而僅有強(qiáng)度的差別，這說明該類蛋白具有較強(qiáng)的親金屬離子性質(zhì)，在血清和羊水中的含量有較大差異。

對(duì)于4類原理不同的芯片，可以認(rèn)為在H50和GoldChip芯片上獲得的是標(biāo)本中蛋白的天然情況，在WCX2和IMC3芯片獲得的是樣品中蛋白的部分變性增溶后的情況。在WCX2、IMC3、H50芯片上檢測到的是選擇性結(jié)合的蛋白，信號(hào)的強(qiáng)度與蛋白的性質(zhì)和含量有關(guān)，在GoldChip芯片上檢測到的為非選擇性結(jié)合的蛋白，信號(hào)的強(qiáng)度僅與蛋白含量有關(guān)，在WCX2芯片上檢出3 720～5 810 Da的8個(gè)蛋白，在其他芯片上并未檢出，這是因?yàn)槭褂肳CX2芯片時(shí)，樣品在預(yù)處理過程中使用了還原劑打開二硫鍵。

根據(jù)各芯片提供的信號(hào)判斷，在各類芯片上表現(xiàn)出羊水特異性的蛋白大多不是羊水特有的，相對(duì)血漿而言，羊水中有更高的濃度。綜合分析篩選出的30個(gè)蛋白在4種芯片上的信號(hào)情況，篩選出未在血清檢測到(即沒有“-”信號(hào))且能被更多種類蛋白芯片檢測到(即“+”更多)的蛋白，結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量為11 198、12 705 Da是比較確定的羊水特異性蛋白，但血漿中是否完全沒有此類蛋白有待進(jìn)一步研究。

[1]虞斌，王秋偉，王宇峰. 羊水蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展. 中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，13(1)：69-71.

[2]黃華，陳林興，林美冊(cè)，黃靖宇.表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)在白血病診斷中的應(yīng)用. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2014，22(5)：1273-1277.

[3]靳松，彭建強(qiáng)，林昆，黃愛軍，李亞杰. 動(dòng)態(tài)負(fù)荷力對(duì)軟骨前體干細(xì)胞甲狀旁腺激素相關(guān)肽的影響及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白組研究. 新醫(yī)學(xué)，2014，45(4)：231-235.

[4]杜小祥，郭石平. 表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜蛋白質(zhì)芯片篩查肺癌血清相關(guān)蛋白及其意義. 腫瘤研究與臨床，2014，26(9)：601-604.

[5]Nilsson S, Ramstr?m M, Palmblad M, Axelsson O, Bergquist J.Explorative study of the protein composition of amniotic fluid by liquid chromatography electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.J Proteome Res，2004，3(4):884-889.

[6]Mussap M, Fanos V, Piccoli A, Zaninotto M, Padovani EM, Plebani M.Low molecular mass proteins and urinary enzymes in amniotic fluid of healthy pregnant women at progressive stages of gestation.Clin Biochem，1996，29(1):51-56.

[7]Michel PE, Crettaz D, Morier P, Heller M, Gallot D, Tissot JD, Reymond F, Rossier JS.Proteome analysis of human plasma and amniotic fluid by Off-Gel isoelectric focusing followed by nano-LC-MS/MS.Electrophoresis，2006，27(5-6):1169-1181.

[8]Nakayama M, Nakajima D, Nagase T, Nomura N, Seki N, Ohara O.Identification of high-molecular-weight proteins with multiple EGF-like motifs by motif-trap screening. Genomics，1998，51(1):27-34.

[9]Liu T, Qian WJ, Gritsenko MA, Camp DG 2nd, Monroe ME, Moore RJ, Smith RD. Human plasma N-glycoproteome analysis by immunoaffinity subtraction, hydrazide chemistry, and mass spectrometry. J Proteome Res，2005，4(6):2070-2080.

(本文編輯：林燕薇)

Analysisoffingerprintpatternsofamnioticfluidandplasmaproteinsinhealthypregnantwomen

ZhuBin,ZhouJian,ChenFang,LiLihong,YeZhihai,XiaLuquan.

DepartmentofGynecologicalOncolagy,HexianMemorialHospitalPanyu,Guangzhou511400,China

,ZhuBin,E-mail：2547695010@qq.com

ObjectiveTo explore the proteins specifically-expressed in the amniotic fluid (AF) by comparing the fingerprint patterns of in the AF and plasma proteins, aiming to provide molecular evidence for obstetrics research.MethodsSurface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) with four different protein-chips was utilized to investigate the fingerprint patterns of AF and plasma proteins from 12 healthy full-term pregnant women.ResultsIn total, 150 protein signals (signal-to-noise ratio>3) were detected in the AF and 250 in the plasma. Thirty proteins were detected specifically expressed in the AF using four types of protein-chips. The proteins with a molecular weight of 11198 Da and 12705 Da were confirmed to be specifically expressed in the AF.ConclusionThe AF contains specifically-expressed proteins, which probably play a vital role in the physiological and pathological progresses during pregnancy.

Amniotic fluid; Plasma; Protein fingerprint pattern

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目(2010B031600179)

511400 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬何賢紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科(朱斌，周堅(jiān)，陳芳，黎麗紅);519080 珠海，百奧生物工程有限公司(葉志海，夏魯全)

，朱斌，E-mail：2547695010@qq.com

2015-03-22)