周立兵 李新鋼

基礎研究論著

左卡尼汀對老年大鼠腦缺血再灌注損傷HMGB1表達的影響

周立兵 李新鋼

目的探討左卡尼汀預處理對老年大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用以及對高遷移率族蛋白1(HMGB1)表達的影響。方法將45只SD老年大鼠隨機分為3組各15只，包括假手術組(SHAM組)、缺血再灌注組(IR組)、左卡尼汀干預組(LC組)。LC組及IR組通過右側大腦中動脈栓塞法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。LC組于大鼠腦缺血再灌注建模前連續(xù)每日注射左卡尼汀200 mg/kg共1周。建模后24 h留取大鼠血漿以及腦組織標本。采用原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法(TUNEL法)檢測各組大腦皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡情況。采用ELISA檢測各組血漿HMGB1、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛的表達。采用蛋白免疫印跡法檢測各組腦組織HMGB1蛋白的表達。結果與SHAM組凋亡指數(shù)(0.4±0.1)%相比，IR組凋亡指數(shù)(45.1±4.2)%更高(P<0.05)，而LC組凋亡指數(shù)(26.5±3.8)%低于IR組(P<0.05)。IR組及LC組的血漿HMGB1水平均高于SHAM組(P均<0.05)。LC組血漿HMGB1、丙二醛水平低于IR組,SOD水平高于IR組(P均<0.05)。LC組腦組織HMGB1水平低于IR組(P<0.05)。結論左卡尼汀可能通過減少HMGB1的表達來減輕腦缺血再灌注老年大鼠的腦損傷。

左卡尼汀；腦缺血再灌注；高遷移率族蛋白1

缺血性腦血管病是嚴重威脅人類健康的疾病，其特點為病死率以及致殘率較高，預后差。腦缺血恢復再通后損傷并未減輕，反而加重的現(xiàn)象稱為腦缺血再灌注損傷。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是晚期炎癥因子，其與腦缺血再灌注損傷息息相關[1-4]。左卡尼汀是能量代謝中的必需物質(zhì)，研究表明其對腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用[1-2]。本研究旨在觀察左卡尼汀對腦缺血再灌注損傷HMGB1表達的作用, 以探討其在腦缺血再灌注損傷中的保護機制。

材料與方法

一、實驗材料

浙江大學醫(yī)學院動物實驗室提供的SD老年大鼠，雌性清潔級，共45只，260～360 g，出生12個月以上。TUNEL試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

二、動物分組和模型的建立

實驗分組：45只大鼠隨機分為3組各15只，包括假手術組(SHAM組)、缺血再灌注組(IR組)、左卡尼汀干預組(LC組),LC組于大鼠腦缺血再灌注建模前連續(xù)每日注射左卡尼汀200 mg/kg共1周。

LC組及IR組通過右側大腦中動脈栓塞法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型：于大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)進行麻醉，切開其頸部,分離右側頸部動脈，夾閉右頸總動脈及右頸內(nèi)動脈，在頸外動脈起始端剪開一小切口，插入直徑0.236 mm的進口魚線,以分岔口處開始測量距離,插入1.8～2 cm后固定魚線,縫合。缺血2 h后將線栓拉出1 cm左右即可形成再灌注。其后分2次緩慢拔出栓線，結扎血管,再灌注12 h。SHAM組插入1.0 cm魚線，其余步驟同上。IR組夾閉過程中死亡1只，予以剔除。建模后24 h留取血漿以及腦組織標本。

三、腦梗死體積的測定

再灌注12 h后，麻醉大鼠、快速斷頭取其腦組織，將腦組織切片置于2%氯代三苯基四氮唑(TTC)溶液中染色固定?？梢姽Ｋ涝顓^(qū)呈白色，正常組織呈紅色，部分組織由白色向紅色過渡。用計算機病理圖像分析儀掃描圖像并計算出梗死灶體積。

四、原位末端脫氧核苷酸轉移酶標記法(TUNEL法)檢測SHAM、IR、LC組腦組織細胞凋亡情況

于4%多聚甲醛中固定腦組織，脫水、浸蠟、包埋，按照說明書操作。于熒光顯微鏡下觀察，陽性凋亡細胞的細胞核呈綠色顆粒狀，采用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件計數(shù)凋亡細胞，計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=陽性細胞/(陽性細胞+陰性細胞)×100%。

五、ELISA檢測SHAM、IR、LC組血漿HMGB1、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛的表達

于試驗終點時，暴露大鼠下腔靜脈，抽其靜脈血進行離心，根據(jù)實驗說明書進行操作。根據(jù)標準曲線，檢測各組血漿HMGB1、SOD、丙二醛的水平。

六、蛋白免疫印跡法檢測SHAM、IR、LC組腦組織HMGB1蛋白的表達

隨機選取各組5只大鼠，處死后立即取其腦組織，采用蛋白免疫印跡法檢測其腦組織HMGB1的表達。參照說明書進行操作，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。使用LabWork 4.0圖像分析軟件進行檢測。

七、統(tǒng)計學處理

結 果

一、SHAM、IR、LC組腦梗死體積比較

IR組與LC組腦梗死面積較SHAM組大(P<0.05)，提示存在腦缺血再灌注。LC組腦梗死體積較IR組小(P<0.05)，見表1。

表1 IR組、SHAM組、LC組腦梗死體積比較

注：與SHAM組比較，aP<0.05；與IR組比較，bP<0.05；兩兩比較結果，SHAM組與IR組比較的t=-32.416、P<0.001，SHAM組和LC組比較的t=-25.976、P<0.001，IR組和LC組比較的t= 6.892、P<0.001

二、SHAM、IR、LC組腦組織細胞凋亡情況

與SHAM組凋亡指數(shù)(0.4±0.1)%相比，IR組凋亡指數(shù)(45.1±4.2)%更高(P<0.05)，LC組凋亡指數(shù)(26.5±3.8)%也低于IR組(P<0.05)。3組比較總的F=696.805、P<0.001，SHAM組和IR組比較的t= -37.073、P<0.001，SHAM組和LC組比較的t=-22.030、P<0.001，IR組和LC組比較的t=15.426、P<0.001。熒光顯微鏡下觀察各組的凋亡細胞見圖1。提示左卡尼汀可以減輕腦缺血再灌注大鼠腦細胞的凋亡程度，具有腦組織保護作用。

圖1 SHAM、IR、LC組熒光顯微鏡下凋亡細胞圖(×400)

三、SHAM、IR、LC組血漿HMGB1、SOD及丙二醛水平的比較

IR組及LC組的血漿HMGB1水平均高于SHAM組(P均<0.05)。LC組血漿HMGB1、丙二醛水平低于IR組,SOD水平高于IR組(P均<0.05)，提示左卡尼汀可降低丙二醛表達，增加SOD表達，減輕腦組織損傷。

表2 SHAM、IR、LC組血漿HMGB1、SOD及丙二醛水平的比較

注：與SHAM組比較，aP<0.05;與IR組比較，bP<0.05；SOD兩兩比較結果，SHAM組和IR組比較的t= 13.376、P<0.001，SHAM組和LC組比較的t=10.420、P<0.001，IR組和LC組比較的t=-3.138、P=0.003；MDA兩兩比較結果，SHAM組和IR組比較的t=-12.080、P<0.001，SHAM組和LC組比較的t=-5.616、P<0.001，IR組和LC組比較的t=6.561、P<0.001；HMGB1兩兩比較結果，SHAM組和IR組比較的t=-11.290、P<0.001，SHAM組和LC組比較的t=-5.343、P<0.001，IR組和LC組比較的t= 6.039、P<0.001

四、SHAM、IR、LC組腦組織HMGB1水平的比較

LC組腦組織HMGB1水平低于IR組(P<0.05)，提示經(jīng)左卡尼汀干預后可明顯抑制HMGB1的表達，見圖2。

圖2 SHAM、IR、LC組腦組織HMGB1水平的比較

A：3組間HMGB1水平差異具有統(tǒng)計學意義(F=453.342，P<0.001)，與SHAM組比較，*為P<0.001，與IR組比較，**為P<0.001；兩兩比較結果, SHAM組與IR組比較的t=-29.705、P<0.001，SHAM組與IC組比較的t=-10.585、P<0.001,IR組與IC組比較的t=19.121、P<0.001。B：蛋白免疫印跡電泳圖，可見LC組HMGB1的表達低于IR組

討 論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制較多, 其中炎癥反應是導致腦組織損傷的重要因素，炎癥反應中期，大量促炎細胞因子釋放、引起炎癥瀑布反應，造成微血管功能障礙、組織水腫及損傷。炎癥反應的晚期，腫瘤壞死因子-α、IL-1等細胞因子可通過活化單核巨噬細胞促進HMGB1的釋放，作用于單核細胞等,導致炎癥級聯(lián)反應，加重組織損傷[3-4]。Chen等[5]的研究顯示，腦缺血損傷患者早期血漿HMGB1表達較正常水平高13倍。我們的研究顯示，腦缺血再灌注大鼠的腦組織及血漿中HMGB1的表達均高于SHAM組，提示HMGB1參與了腦缺血再灌注損傷過程，這與Lee等[6]的研究一致。

左卡尼汀又稱左旋肉堿，是能量代謝物質(zhì)，Virmani等[7]發(fā)現(xiàn)左卡尼汀β-氧化滿足腦缺血再灌注損傷時的ATP能量需求。Martin等[8]發(fā)現(xiàn)左卡尼汀能提高丙酮酸脫氫酶的活性，減少腦乳酸的生成，提高葡萄糖的利用率，對腦缺血再灌注損傷起保護作用。Alves等[9]研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦缺血再灌注損傷后應用左卡尼汀治療,其神經(jīng)功能缺損有所改善,凋亡細胞數(shù)量降低,具有神經(jīng)保護作用。還有研究表明左卡尼汀可以提高腦組織中抗氧化酶活性、抑制氧自由基產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化反應，增加海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)量，從而保護損傷腦組織[10]。

本研究結果顯示，與IR組比較，LC組腦細胞凋亡指數(shù)較低，HMGB1及丙二醛的水平較低，SOD的水平較高，提示左卡尼汀可減輕炎癥因子HMGB1的表達，具有抗氧化等作用，可保護腦組織。因此我們推測左卡尼汀對腦組織的保護作用可能與其抑制HMGB1的表達有關。

綜上所述，左卡尼汀可能是通過抑制HMGB1的表達來減輕腦細胞凋亡，對腦缺血再灌注損傷起保護作用，但其具體的分子調(diào)控機制，尚需我們進一步深入研究。

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EffectoflevocarnitineontheexpressionofHMGB1ofagedratsaftercerebralischemiareperfusioninjury

ZhouLibing,LiXingang.

DepartmentofNeurosurgery,QiluHospitalofMedicalCollegeofShandongUniversity,Ji’nan250012,China

,LiXingang,E-mail:yesterdaygun@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of levocarnitine pretreatment on cerebral ischemia reperfusion injury and the expression of high mobility group protein 1 (HMGB1) of aged rats.MethodsForty five aged SD rats were randomly divided into three groups: sham group, ischemia reperfusion group (IR) and levocarnitine (LC) group. The ischemia reperfusion rat model are prepared by right middle cerebral artery embolism. The rats were daily injected with levocarnitine (200 mg/kg) for one week before preparing ischemia reperfusion animal model in LC group. 24 hours after finishing models, the plasm and brain of the rats were removed and remained. The apoptosis status in the cerebral cortex of the rats were detected and evaluated by TUNEL. The expressions of HMGB1, superoxide dismutase (SOD), malonaldehyde(MDA) were detected by ELISA. The expressions of HMGB1 protein in brain was detected by western blot.ResultsThe apoptosis indexes of the rats in the IR group(45.1±4.2)% were significantly increased compared with those of the sham group(0.4±0.1)%(P<0.05), and the apoptosis indexes of the rats in the LC group(26.5±3.8)% were significantly lower than that of IR group(P<0.05). The levels of HMGB1 of the rats in the IR group and LC group were significantly increased compared with those of the rats in the sham group(P<0.05). Compared with IR group, The levels of HMGB1 and MDA of the rats in the LC group were significantly decreased and the levels of SOD significantly increased(P<0.05). The brain expression of HMGB1 of the rats in the LC group were significantly lower than that of RI group(P<0.05).ConclusionLevocarnitine may relieve the brain injury of aged rats with ischemic reperfusion by decreasing the expression of HMGB1.

Levocarnitine；Cerebral ischemia reperfusion injury；High mobility group protein 1

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.003

山東省樂陵市科技局項目(2013-SL-8)

250012 濟南，山東大學醫(yī)學院齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科(周立兵，李新鋼)；253600 樂陵，樂陵市人民醫(yī)院神經(jīng)外科(周立兵)

,李新鋼，E-mail:yesterdaygun@126.com

2015-02-26) (本文編輯：洪悅民)