忽海洋,白 莉,馬文艷,劉亭亭,陳還珍

吡格列酮通過pCREB蛋白對大鼠缺血再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制的研究

忽海洋,白 莉,馬文艷,劉亭亭,陳還珍

目的通過檢測大鼠心肌缺血再灌注p-CREB蛋白表達(dá)的變化,探討吡格列酮對大鼠缺血再灌注損傷心肌保護(hù)機(jī)制。方法將55只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、吡格列酮組、吡格列酮+GW9662組,左前降支結(jié)扎的方法建立缺血再灌注損傷模型,伊文思藍(lán)染色測定心肌梗死面積,Western blot法測定心肌組織p-CREB蛋白表達(dá)。結(jié)果吡格列酮組梗死面積與缺血再灌注組比較明顯減少(P<0.05),與吡格列酮組比較,吡格列酮+GW9662組梗死面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組和缺血再灌注組相比,吡格列酮組p-CREB蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05),吡格列酮+GW9662組p-CREB蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05);與吡格列酮組相比,吡格列酮+GW9662組p-CREB蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論吡格列酮可能上調(diào)p-CREB蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷,GW9662可逆轉(zhuǎn)吡格列酮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

缺血-再灌注損傷;吡格列酮;p-CREB蛋白

隨著臨床上對于急性冠脈綜合征的溶栓、介入、冠狀動脈搭橋等治療的廣泛應(yīng)用,使冠心病的治療進(jìn)入再灌注時期,冠狀動脈再通后都將直接面臨心肌缺血再灌注損傷(MIRI)等重大的臨床問題。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在細(xì)胞再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,抗凋亡機(jī)制可能是減輕再灌注損傷的新方法。既往發(fā)現(xiàn)噻唑烷二酮類藥物對缺血再灌注損傷有保護(hù)作用,主要是減輕心肌細(xì)胞凋亡[1,2]。CREB是環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)應(yīng)答元件結(jié)合蛋白的簡稱,對細(xì)胞的增殖、再生起重要的作用。最初發(fā)現(xiàn)CREB與學(xué)習(xí)及記憶功能有密切關(guān)系,近年研究顯示p-CREB對循環(huán)系統(tǒng)也發(fā)揮重要作用[3]。但關(guān)于吡格列酮在缺血再灌注時p-CREB蛋白表達(dá)的影響報道較少。本實(shí)驗在原有研究基礎(chǔ)上,觀察過氧化物酶體增殖物激活受體-r(peroxisome proliferators-act-i vated receptor-r,PPARr)激活劑吡格列酮對大鼠缺血再灌注(I/R)心肌p-CREB蛋白表達(dá)的影響,以進(jìn)一步探討吡格列酮抗缺血再灌注損傷的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品和試劑 鹽酸吡格列酮片由日本武田藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn);GW9662由Pfizer輝瑞公司生產(chǎn);伊文思藍(lán)由江萊生物公司生產(chǎn);環(huán)磷酸腺苷(cAMP)反應(yīng)元件結(jié)合蛋白一抗由Cell Signal公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗動物及分組 健康雄性SD大鼠55只,體重250 g～300 g,山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心提供。實(shí)驗動物隨機(jī)分成4組。假手術(shù)組(10只):生理鹽水2 mL/d灌胃;缺血再灌注組(15只):生理鹽水2 mL/d灌胃;吡格列酮組(15只):吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃;吡格列酮+過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)特異性阻斷劑GW9662組(吡格列酮+GW9662組, 15只):吡格列酮10 mg/(kg·d)灌胃,缺血再灌注前30 min靜脈注射GW9662。各組灌胃2周后制作大鼠在體心肌I/R模型。假手術(shù)組只開胸穿線,不結(jié)扎冠狀動脈。

1.3 方法

1.3.1 模型建立[4]腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠(3 mL/kg),心電圖監(jiān)測。切開氣管進(jìn)行插管,調(diào)整吸呼比1∶2,通氣頻率60次/min。暴露心臟后在冠狀動脈根部1 mm～2 mm處用帶6/0線的眼科針穿過肺動脈竇和左心耳之間,墊一塑料管后用止血鉗夾緊,觀察左室前壁心肌顏色及心電圖動態(tài)演變。心肌組織顏色變暗或心電圖ST段抬高或下降,判斷為結(jié)扎成功。缺血30 min后放松結(jié)扎部位,使冠狀動脈再通120 min。再灌完成后剪下心臟,液氮冷凍心室前壁留取的組織,檢測心肌梗死面積及提取蛋白質(zhì)。假手術(shù)組只穿線但不結(jié)扎冠狀動脈,暴露心臟150 min。

1.3.2 心肌梗死面積測定[5]除假手術(shù)組外每組各取大鼠5只,再灌注完成后重新結(jié)扎先前部位,用2%的伊文思藍(lán)2 mL經(jīng)腹腔靜脈注入,使心臟染色以區(qū)分非缺血區(qū)(藍(lán)染區(qū))和缺血區(qū)(非藍(lán)染區(qū)),迅速取下心臟,剪去心房和右室后無菌紗布吸干表面水分,放入-20℃冷藏,沿長軸切成1 mm～2 mm的薄片5張,將切片浸入1%TTC的磷酸緩沖液中(pH值7.4)37℃孵育30 min,再用10%的甲醛固定24 h以增強(qiáng)染色顏色對比,照相。心肌組織分為:藍(lán)色為正常心肌,淺紅色為缺血未梗死心肌,灰白色為梗死心肌。通過計算機(jī)圖像分析軟件計算梗死心肌占左室面積百分比(IR/LV)。

1.3.3 Western blot法測定p-CREB蛋白表達(dá) 提取心肌組織勻漿液,用BCA法檢測蛋白定量,進(jìn)行蛋白制樣,配制SDS-PAGE凝膠,然后提取上樣量40 g/lane,采用BIO-RAD電泳系統(tǒng)80 V 45 min濃縮, 100 V 80 min進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜200 mA 2 h、5%脫脂奶粉封閉,加入cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白一抗,稀釋濃度為1∶10 000,加入二抗進(jìn)行雜交2 h,化學(xué)發(fā)光顯色,按相對比值進(jìn)行相對定量,即各蛋白目的條帶光密度相對強(qiáng)度=各蛋白目的條帶灰度值/假手術(shù)組蛋白目的條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,實(shí)驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間數(shù)據(jù)比較采用ANOVA檢驗,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 吡格列酮組梗死面積與缺血再灌注組比較明顯減小(P<0.05),吡格列酮+GW9662組梗死面積與缺血再灌注組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與吡格列酮組比較,吡格列酮+GW9662組梗死面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)%

表1 各組大鼠心肌梗死面積比較(±s)%

組別n 心肌梗死面積缺血再灌注組1023.69±0.74吡格列酮組1013.73±0.781)吡格列酮+GW9662組1021.68±0.712)與缺血再灌注組相比,1)P<0.05;與吡格列酮組相比, 2)P<0.05。

2.2 Western blot法分析p-CREB蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組比較,缺血再灌注組p-CREB蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與缺血再灌注組比較,吡格列酮組p-CREB蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而吡格列酮+GW9662組p-CREB蛋白表達(dá)無明顯變化;與吡格列酮組比較,吡格列酮+ GW9662組p-CREB蛋白表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組p-CREB/βactin蛋白譜帶密度相對值比較(±s)

表2 各組p-CREB/βactin蛋白譜帶密度相對值比較(±s)

組別n pCREB/βactin假手術(shù)組100.057 2±0.033 9缺血再灌注組100.115 1±0.028 0吡格列酮組100.542 3±0.059 01)吡格列酮+GW9662組100.252 1±0.112 12)與缺血再灌注組相比,1)P<0.05;與吡格列酮組相比, 2)P<0.05。

3 討 論

在搶救缺血再灌注損傷心肌的同時也會帶來心肌的損傷,目前最重要的是為缺血心肌從再灌注治療中取得最佳療效。炎癥介質(zhì)及氧自由基在再灌注損傷中起重要作用,如何防治缺血再灌注損傷已成為目前研究的主要內(nèi)容[5]。近年來臨床上藥物及缺血預(yù)適應(yīng)等用來保護(hù)再灌注損傷的心肌,有明顯抑制缺血再灌注心肌凋亡的作用[6]。由于缺血再灌注過程有著復(fù)雜的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,涉及細(xì)胞外、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)信號通路及其效應(yīng)器等多種的變化,有著多環(huán)節(jié)、多層次的交互作用。繼續(xù)研究再灌注損傷過程的細(xì)胞分子機(jī)制,對臨床防治缺血再灌注損傷提供新的思路[7]。

噻唑烷二酮類藥物是PPAR激活劑作為胰島素增敏劑,降低胰島素抵抗來治療2型糖尿病[8]。有研究證明,吡格列酮可以增加Bcl-2的表達(dá),抑制凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá),與劑量依賴性相關(guān),從而減少缺血-再灌注心肌細(xì)胞凋亡[9]。有研究發(fā)現(xiàn),CREB對于心肌細(xì)胞神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和胰腺B細(xì)胞等發(fā)揮抗凋亡作用[10]。本實(shí)驗采用Western blot法檢測了p-CREB的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)吡格列酮預(yù)處理能夠增加p-CREB蛋白表達(dá),提示吡格列酮可能通過上調(diào)p-CREB蛋白表達(dá)而發(fā)揮抗心肌凋亡作用。短期給予吡格列酮治療后,能減輕心肌缺血再灌注后的病理損傷及減少細(xì)胞的凋亡,改善心功能,對缺血再灌注損傷起到了保護(hù)的作用,給予GW9662后p-CREB蛋白的表達(dá)降低。因此,推測吡格列酮可能通過PPAR途徑介導(dǎo)使p-CREB蛋白表達(dá)增加而抑制了心肌細(xì)胞凋亡。

吡格列酮減輕心肌缺血再灌注損傷機(jī)制可能與其上調(diào)p-CREB蛋白的表達(dá)有關(guān),提示p-CREB蛋白通路可能是吡格列酮發(fā)揮心肌保護(hù)作用的信號途徑之一。然而,對于吡格列酮如何通過p-CREB蛋白途徑減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗研究,為吡格列酮的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

[1] Cao ZL,Ye P,Long CL,et al.Effect of pioglitazone,aperox-isome proliferator-activate dreceptor gamma agonist,on ischemia-reperfusion injury in rats[J].Pharmacol,2007,79(3):184-192.

[2] 曹澤玲,葉平,龍超良,等.吡格列酮對大鼠心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)研究[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2005,10(10):1112-1117.

[3] Marais E,Genade S,Lochner A.CREB activation and ischaemicpreconditioning[J].Cardioase Drugs Ther,2008,22(1):3-17.

[4] 李國營,田素民,于連發(fā),等.缺血及缺血再灌注模型的制備[J].解剖學(xué)研究,2002,24(3):237-238.

[5] 昝香怡,李培杰,張正義,等.阿片受體拮抗劑對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2007,19(11): 693-694.

[6] 馮全洲,李天德,王兆霞,等.鈣離子拮抗劑對大鼠心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2004,16(3):133-136.

[7] 韓笑,劉建勛.心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報,2004,20(1):4-7.

[8] 張旭,王蓉羅.格列酮與阿爾茨海默病[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2011,32(1):95-99.

[9] 李健,馮義柏,田莉,等.吡格列酮預(yù)處理對大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡和線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響[J].臨床心血管病雜志, 2008,24(8):620-624.

[10] 廖金文,唐明德,肖唬.復(fù)方丹參滴丸對心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其對CREB表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2013,53(1):29-32.

R542.2R256.2

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.021

:1672-1349(2015)02-0193-03

2014-04-15)

(本文編輯郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原030001)

陳還珍,E-mail:hhy1984beijing@163.com