謝園園，徐元宏，聞慧琴，3，王書書，李源玲，儲德勇，沈繼龍

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

弓形蟲棒狀體ROP16基因轉(zhuǎn)染RAW 264.7的實(shí)驗(yàn)研究

謝園園1，徐元宏2，聞慧琴2，3，王書書1，李源玲1，儲德勇1，沈繼龍1

摘要目的比較目前常用的5種基因?qū)爰夹g(shù)將弓形蟲棒狀體ROP16基因?qū)隦AW264．7，選擇合適的方法提高轉(zhuǎn)染效率。方法以綠色熒光蛋白pEGFP-ROP16融合表達(dá)構(gòu)建質(zhì)粒，采用Lipofectamine?3000、Attractene、Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑以及電穿孔轉(zhuǎn)染和慢病毒載體感染RAW264．7，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察目的基因的表達(dá)、細(xì)胞生長狀態(tài)并分析轉(zhuǎn)染效率，從而確定最佳的基因?qū)胪緩?。結(jié)果上述質(zhì)粒載體對RAW264．7的轉(zhuǎn)染效率依次為電轉(zhuǎn)法＞Fugene?HD＞Lipofectamine?3000＞Attractene。但是電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率較高，細(xì)胞貼壁不牢或死亡；而慢病毒感染效率可達(dá)61．2%，細(xì)胞生長狀態(tài)佳，顯著優(yōu)于質(zhì)粒載體（P ＜0．05）。慢病毒組顯著優(yōu)于4個質(zhì)粒組（P＜0．05）。結(jié)論慢病毒感染可將弓形蟲棒狀體ROP16成功轉(zhuǎn)入RAW264．7，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，效果顯著優(yōu)于質(zhì)粒載體，目的基因在細(xì)胞內(nèi)獲得高效表達(dá)。為弓形蟲ROP16的功能研究提供了重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞ROP16基因；RAW264．7；慢病毒感染

弓形蟲廣泛寄生于溫血動物的有核細(xì)胞內(nèi)，能夠侵入單核巨噬細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖。棒狀體蛋白16（rhoptry protein 16，ROP16）是由蟲體棒狀體分泌的重要毒力相關(guān)因子，具有激酶樣活性，可以直接磷酸化Stat3和Stat6［1－2］，上調(diào)白介素（interleukin，IL）-4和下調(diào)IL-12的表達(dá)，誘導(dǎo)替代活化型巨噬細(xì)胞（alternatively activated amcrophage，M2）／輔助性T細(xì)胞2（helper T cell2，Th2）的免疫偏移或極化。研究［3－4］表明，ROP16蛋白可促進(jìn)M2的活化及Th2應(yīng)答。巨噬細(xì)胞在機(jī)體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學(xué)功能［5］。目前對于巨噬細(xì)胞的研究［6］主要著重于其異質(zhì)性，在不同的微環(huán)境條件下可向經(jīng)典活化型或M2偏移或者極化，各自發(fā)揮不同的細(xì)胞內(nèi)殺傷、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和組織重構(gòu)等作用。目前研究［7－8］的細(xì)胞載入技術(shù)主要有非病毒導(dǎo)入系統(tǒng)（磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、電穿孔法等）和病毒導(dǎo)入系統(tǒng)（病毒載體）。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，且大都操作較復(fù)雜，轉(zhuǎn)染效率較低，設(shè)備要求較高。該研究分別采用ROP16重組質(zhì)粒和重組慢病毒將目的基因?qū)胄∈髥魏司奘杉?xì)胞白血病細(xì)胞系RAW264．7，采用Lipofectamine?3000、Attractene、Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑，及電穿孔轉(zhuǎn)染法、慢病毒感染法轉(zhuǎn)染RAW264．7，比較5種基因?qū)敕椒ǖ霓D(zhuǎn)染效率，為深入研究ROP16的結(jié)構(gòu)及其功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細(xì)胞與主要試劑

RAW 264．7巨噬細(xì)胞系購自上海中科院研究所；Lipofectamine?3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；Attractene轉(zhuǎn)染試劑（德國QIAGEN公司）；Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑（美國Promega公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（加拿大Wisent公司）；OptiMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；AxyPrep質(zhì)粒大量提取試劑盒（美國Axygen公司）；胰酶和青霉素、鏈霉素（上海碧云天公司）；L-谷氨酰胺（北京Solarbio公司）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司）；通用型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)高質(zhì)染色試劑盒（上海江萊公司）；DAPI染色試劑盒（上海貝博生物）；慢病毒試劑盒（上海吉凱基因公司）。

1．1．2主要儀器

電穿孔儀、2 mm石英電轉(zhuǎn)杯（美國BioRad公司）；熒光顯微鏡IX71（日本Olympus公司）；流式細(xì)胞儀FACS Calibur（美國BD公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡SP5-DMI6000（德國LEICA公司）；超凈工作臺（蘇州安泰公司）。

1．2方法

1．2．1質(zhì)粒提取

弓形蟲Wh3蟲株ROP16基因

2015－05－26接收

科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2檢驗(yàn)科、3輸血科，合肥230022

沈繼龍，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shenjilong53＠126．com；

儲德勇，男，副教授，責(zé)任作者，E-mail：chudeyong＠126．com由安徽省病原生物學(xué)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增，總長2 124 bp。構(gòu)建包含pE綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-ROP16的質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，單菌落增菌培養(yǎng)200 m l。用AxyPrep質(zhì)粒大量提取試劑盒抽提和純化質(zhì)粒，溶解于滅菌超純水，濃度調(diào)整為1 mg／ml，光密度（optical delnsity，OD）值OD260／OD280＝1．9。

1．2．2細(xì)胞復(fù)蘇與傳代

按常規(guī)方法復(fù)蘇RAW264．7，培養(yǎng)于含15%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)液中，在5%CO2和37℃飽和濕度下傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳3代，密度達(dá)到80%左右時，用0．25%胰酶消化并移入試管中，1 000 r／min離心5 min，棄上清液后，用1 m l上述培養(yǎng)液重懸計數(shù)。將細(xì)胞傳至6孔板，1×106個／孔，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，待每孔內(nèi)的細(xì)胞生長到70%～80%密度時開始轉(zhuǎn)染。

1．2．3流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率

收集鋪好在6孔板內(nèi)的基因?qū)胩幚砗蟮募?xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；用PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000 r／min、離心5 min），收集1×105～5×105細(xì)胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5μl Annexin VFITC混勻后，4℃避光，反應(yīng)15 min；用PBS洗滌細(xì)胞1次（2 000 r／min、離心5 min），500μl PBS重懸細(xì)胞；上流式細(xì)胞儀前5 min加入5μl PI，混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，上機(jī)檢測（1 h內(nèi)，進(jìn)行熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測）。因蛋白為GFP，調(diào)試好流式細(xì)胞儀后，得出圖后將橫坐標(biāo)改為FITC通道，縱坐標(biāo)改為直方圖，可直接導(dǎo)出轉(zhuǎn)染效率數(shù)值的流式圖。

1.3Lipofectam ine3000轉(zhuǎn)染法

按Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟操作，轉(zhuǎn)染前更換細(xì)胞液。取EP管2個，1號管OptiMEM培養(yǎng)液125μl 與5μl lip3000轉(zhuǎn)染試劑混勻，2號管OptiMEM培養(yǎng)液125μl與10μl P3000和5μg質(zhì)?；靹颍瑢?號管混勻后加入1號管，輕輕吹打混勻后室溫孵育5 min，加入6孔板，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)弱，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4Attractene轉(zhuǎn)染法

根據(jù)Attractene轉(zhuǎn)染試劑說明書針對RAW 264．7的操作步驟，轉(zhuǎn)染前更換細(xì)胞液。取EP管1個，加100μl OptiMEM培養(yǎng)液，加入1．2μg質(zhì)粒，再加入轉(zhuǎn)染試劑4．5μl，室溫孵育10～15 min，加入6孔板內(nèi)，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)弱，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.5Fugene?HD轉(zhuǎn)染法

按Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑盒操作步驟，轉(zhuǎn)染前無需換液。取EP管1個，加150μl OptiMEM培養(yǎng)液，先加入質(zhì)粒3．3μg；再加入Fugene?HD轉(zhuǎn)染試劑12μl，以得到適當(dāng)?shù)脑噭┡c質(zhì)粒的比例，輕柔混勻后，室溫孵育10～15 min，加入6孔板，24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)弱，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1．6電轉(zhuǎn)染法

當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%匯合時，胰酶消化后，加入培養(yǎng)基終止，和培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移至50 m l的一次性離心管，用血球計數(shù)器確定細(xì)胞密度，然后在4℃、1 500 r／min離心10 min，去除上清液。用電轉(zhuǎn)染液cytomix重懸細(xì)胞，至3．75×107細(xì)胞／m l密度。添加200μl的細(xì)胞和10μg質(zhì)粒于電轉(zhuǎn)染杯中，在室溫下孵育10 min，然后將電轉(zhuǎn)染杯置于電轉(zhuǎn)染儀中，設(shè)置電壓與電容參數(shù)后電擊。電擊后迅速轉(zhuǎn)移至含有6 m l培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，并在5%CO2、37℃孵育箱中孵育，24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)弱，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1．7慢病毒感染法

1．7．1宿主細(xì)胞的準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)前保證細(xì)胞良好生長狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)前1 d接種5×103個細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板中，所加培養(yǎng)液體積為每孔90μl，1次實(shí)驗(yàn)需要20個孔。進(jìn)行病毒感染時細(xì)胞的匯合率約為50%左右。根據(jù)不同感染條件分為4組：①A組為正常培養(yǎng)基中直接加病毒感染；②B組為加病毒同時在培養(yǎng)基中添加5μg／m l的聚凝胺；③C組是將培養(yǎng)基更換成ENi．S．后加入病毒感染；④D組為在ENi．S．加病毒同時加5μg／ml的聚凝胺，每組均設(shè)有3個不同梯度的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）。在5%CO2、37℃孵育箱孵育8～12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)，棄去細(xì)胞上清液，更換新鮮培養(yǎng)液。感染3 d后，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光表達(dá)情況。

1．7．2細(xì)胞的感染

種植RAW264．7于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合約50%時，正常培養(yǎng)液中直接加病毒感染，在5%CO2、37℃孵育箱孵育，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)及熒光強(qiáng)弱，72 h后用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

2　結(jié)果

正常的RAW264．7細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，細(xì)胞在體外為激活狀態(tài)時，可呈多突形，貼壁較為牢固（圖1F）。

2.1Lipofectam ine?3000轉(zhuǎn)染法效果分析

6孔板內(nèi)每孔各含Lipofectamine?3000 5μl、P3000 10 μl和質(zhì)粒5μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達(dá)（圖1A、2A），同樣的轉(zhuǎn)染方法重復(fù)操作3次。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀態(tài)略欠佳，形態(tài)發(fā)生改變，少數(shù)細(xì)胞見有偽足，出現(xiàn)分化，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為6．83%（圖3A）。

2.2Attractene轉(zhuǎn)染法效果分析

6孔板內(nèi)每孔各含Attractene轉(zhuǎn)染試劑4．5μl，質(zhì)粒1．2μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達(dá)（圖1B、2B），同樣的轉(zhuǎn)染方法重復(fù)操作3次。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀態(tài)略欠佳，形態(tài)發(fā)生改變，少量有偽足，出現(xiàn)分化，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為1．05%（圖3B）。

2.3Fugene?HD轉(zhuǎn)染法效果分析

Fugene?HD轉(zhuǎn)染RAW264．7巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑量與質(zhì)粒比例為3．5∶1，6孔板內(nèi)每孔各含轉(zhuǎn)染試劑12μl、質(zhì)粒3．3μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達(dá)（圖1C、2C），同樣的轉(zhuǎn)染方法重復(fù)操作3次。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長狀態(tài)略欠佳，形態(tài)發(fā)生改變，少量有偽足，出現(xiàn)分化，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為10．1%（圖3C）。

2．4電轉(zhuǎn)染法效果分析

根據(jù)多次試驗(yàn)結(jié)果，死亡率均較高，電擊后細(xì)胞狀態(tài)較差。設(shè)置實(shí)驗(yàn)過程中相對較好的電轉(zhuǎn)程序如下：電壓200 V、電容960 μF、電阻無限大。熒光顯微鏡下觀察有GFP表達(dá)（圖1D、2D），同樣的轉(zhuǎn)染方法重復(fù)操作3次。但電轉(zhuǎn)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡率超過50%，大量細(xì)胞不貼壁，處于懸浮狀態(tài)，并出現(xiàn)很多細(xì)胞碎片，貼壁細(xì)胞形態(tài)基本無變化。流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為13．9%（圖3D）。

2．5慢病毒感染法效果分析

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加入病毒質(zhì)粒后在不同的時間點(diǎn)觀察熒光表達(dá)情況，顯示72 h后細(xì)胞熒光表達(dá)較強(qiáng)（圖1E、2E），并且細(xì)胞的生長狀態(tài)佳，形態(tài)發(fā)生改變，一部分細(xì)胞伸出偽足，出現(xiàn)分化，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率為61．2%（圖3E）。慢病毒感染后的細(xì)胞，pEGFP-ROP16質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光，通用型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)高質(zhì)染色試劑盒染色內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)出紅色光，DAPI染色試劑盒染色細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色光（圖4）。

2.65種基因?qū)敕椒ㄞD(zhuǎn)染RAW 264.7的效率比較

用上述常見的5種不同的基因?qū)敕椒ㄌ幚鞷AW264．7，結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)染效率各有不同。不同方法轉(zhuǎn)染效率之間的比較見圖5。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)不屬于正態(tài)分布，用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，各組轉(zhuǎn)染效率不全相同，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。再利用Mann-Whitney U法比較兩兩之間差異性，慢病毒轉(zhuǎn)染法組與其他4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），故慢病毒感染法轉(zhuǎn)染RAW264．7轉(zhuǎn)染效率最高。

3　討論

將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞是研究目的基因功能的重要手段。對于不同大小的目的基因和不同類型的靶細(xì)胞應(yīng)當(dāng)選擇不同的轉(zhuǎn)染方法，以提高轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后靶細(xì)胞的存活率，為后繼實(shí)驗(yàn)提供最佳的實(shí)驗(yàn)條件。巨噬細(xì)胞在機(jī)體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學(xué)功能，通過基因?qū)敫淖兙奘杉?xì)胞的功能進(jìn)而調(diào)節(jié)疾病的免疫狀態(tài)有望成為治療某些疾病的新方法。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕蚱螢? 124 bp的弓形蟲毒力相關(guān)因子ROP16，因GFP在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定，置熒光顯微鏡下易于檢測，因此GFP是常用的標(biāo)記分子［9］。將構(gòu)建帶有GFP-ROP16融合基因的質(zhì)粒導(dǎo)入RAW264．7中。

Lipofectamine?3000屬于陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，其通過靜電作用陽離子脂質(zhì)體可介導(dǎo)反義分子探針吸附于帶負(fù)電荷的靶細(xì)胞表面［10］，脂質(zhì)復(fù)合物通過直接融合或內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，并貯存于核內(nèi)體中，最終經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生目的基因編碼的蛋白。Lipofectamine?3000脂質(zhì)體法是常用的轉(zhuǎn)染方法，研究［11］報道其有轉(zhuǎn)染效率高、安全、細(xì)胞毒性小、無免疫原性等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，對RAW264．7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率只有6．83%，可能的原因是：①可能與細(xì)胞的物種來源有關(guān)，細(xì)胞表面可能缺乏特異性受體［12］；②RAW264．7細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對于懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率相差很大［13］。Attractene是一種非脂質(zhì)體的脂類轉(zhuǎn)染試劑，可轉(zhuǎn)染幾乎所有的貼壁細(xì)胞。其也高度適用于DNA和siRNA或miRNA模擬物／抑制劑的共轉(zhuǎn)染，操作快速簡便，對細(xì)胞毒性極低。但在本實(shí)驗(yàn)中其轉(zhuǎn)染效率只有1．05%。Fugene?HD是一種新型非脂質(zhì)體試劑，試劑中帶正電荷的混合脂類分子與核酸中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。該復(fù)合物的正電荷與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸殘基的負(fù)電荷結(jié)合；或該復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞而攝入。本實(shí)驗(yàn)中，該轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染效率只有10．1%。電穿孔法廣泛應(yīng)用于基因克隆、外源基因的表達(dá)、基因定位、基因圖譜的繪制等研究［14］。雖然有報道［15］電轉(zhuǎn)染具有高效、安全等優(yōu)點(diǎn)，但是電穿孔也存在細(xì)胞死亡率較高，引起細(xì)胞融合從而影響細(xì)胞性狀和生長等問題［16］，本實(shí)驗(yàn)中效率僅為13．9%，宿主細(xì)胞死亡率超過50%，顯然不適于后期實(shí)驗(yàn)的要求。

在基因轉(zhuǎn)染載體中，慢病毒是具有良好前景的一種高效轉(zhuǎn)染載體。慢病毒本身分子穩(wěn)定，對靶細(xì)胞損害小，插入的外源性基因比較穩(wěn)定，而且能把目的基因整合到細(xì)胞核內(nèi)基因組中，所以通過加入適當(dāng)濃度的嘌呤霉素可以進(jìn)行藥物篩選從而穩(wěn)定傳代，并能穩(wěn)定表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)慢病毒感染后，經(jīng)證實(shí)其轉(zhuǎn)染效率高達(dá)61．2%。激光共聚焦掃描圖片顯示弓形蟲棒狀蛋白ROP16基因?qū)隦AW264．7細(xì)胞后主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。普通及熒光顯微鏡下可見基因?qū)牒蟮陌屑?xì)胞生長狀態(tài)良好、形態(tài)發(fā)生改變并伸出偽足，推測宿主細(xì)胞可能被活化，這為后期研究ROP16基因功能以及巨噬細(xì)胞的極化提供了較為合適的實(shí)驗(yàn)條件。為進(jìn)一步穩(wěn)定轉(zhuǎn)染其他具有篩選標(biāo)記的目的基因到RAW264．7細(xì)胞中奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，與質(zhì)粒載體的各種轉(zhuǎn)染方法比較，采用慢病毒載體感染可將弓形蟲ROP16成功轉(zhuǎn)入RAW264．7巨噬細(xì)胞，并獲得目的蛋白的高效表達(dá)，被轉(zhuǎn)入的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。本研究不僅為ROP16誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞偏移／極化的功能研究奠定了基礎(chǔ)，也為獲得其它目的基因在巨噬細(xì)胞內(nèi)的過表達(dá)提供借鑒。

參考文獻(xiàn)

［1］Spiegel R，Bach G，Sury V，etal．Amutation in the saposin A coding region of the prosaposin gene in an infant presenting as Krabbe disease：first report of saposin A deficiency in humans［J］．Mol Genet Metab，2005，84（2）：160－6．

［2］CampanaWM，O＇Brien JS，HiraiwaM，etal．Secretion of prosaposin，amultifunctional protein，by breast cancer cells［J］．Biochim Biophys Acta，1999，1427（3）：392－400．

［3］Jensen K D，Wang Y，Wojno E D，etal．Toxoplasma polymorphic effectors determinemacrophage polarization and intestinal inflammation［J］．Cell Host Microbe，2011，9（6）：472－83．

［4］Biswas S K，Mantovani A．Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets：cancer as a paradigm［J］．Nat Immunol，2010，11（10）：889－96．

［5］曹雪濤．免疫學(xué)前沿進(jìn)展［M］．2版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：78．

［6］Gordon S．Alternative activation ofmacrophages［J］．Nat Rev Immunol，2003，3（1）：23－35．

［7］Sato M，Ito A，Akiyama H，et al．Effects of B-cell lymphoma 2 gene transfer tomyoblast cells on skeletalmuscle tissue formation usingmagnetic force-based tissue engineering［J］．Tissue Eng Part A，2013，19（1－2）：307－15．

［8］Sato M，Ito A，Kawabe Y，et al．Enhanced contractile force generation by artificial skeletal muscle tissues using IGF-1 gene-engineered myoblast cells［J］．JBiosci Bioeng，2011，112（3）：273－8．

［9］Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al．Green fluorescent protein as amarker for gene expression［J］．Science，1994，263（5148）：802 －5．

［10］王冰，張樹彪，周集體，等．陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（8）：1459 －62．

［11］Dass C R，Walker T L，Burton M A．Liposomes containing cationic dimethyl dioctadecyl ammonium bromide：formulation，quality control，and lipofection efficiency［J］．Drug Deliv，2002，9（1）：11－8．

［12］Zuhorn I S，Engberts JB，Hoekstra D．Gene delivery by cationic lipid vectors：overcoming cellular barriers［J］．Eur Biophys J，2007，36（4－5）：349－62．

［13］Smith CC，Lynch AM，Gooderham N J．Evaluating the genetic toxicology of DNA-based products using existing genetic toxicology assays［J］．Mutagenesis，2003，18（3）：259－64．

［14］Valero A，Post JN，van Nieuwkasteele JW，et al．Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device［J］．Lab Chip，2008，8（1）：62－7．

［15］AkashiH，MiyagishiM，Taira K．RNAi expression vectors in plant cells［J］．Methods Mol Biol，2004，252：533－43．

［16］Sandri M，Bortoloso E，Nori A，et al．Electrotransfer in differentiated myotubes：a novel，efficient procedure for functional gene transfer［J］．Exp Cell Res，2003，286（1）：87－95．

中圖分類號R 382．33

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1367－06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81471983，81171606）；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2014A106）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室，合肥230032；安徽醫(yī)

作者簡介：謝園園，女，碩士研究生；

Experim ental study of Toxoplasma ROP16 gene transfection to RAW 264.7

Xie Yuanyuan1，Xu Yuanhong2，Wen Huiqin2，3，et al
（1Dept of Pathogen Biology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Dept of Laboratory，3Dept of

Blood Transfusion，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveFivemost commonly usedmethodswere compared to transfer Toxoplasma gondii rhoptry 16 gene into RAW264．7 in order to select the appropriate technique for improving transfection efficiency．Methods The following fivemethods of Lipofectamine?3000 Transfection Reagent，Attractene Transfection Reagent，F(xiàn)ugene?HD Transfection Reagent，electroporation transfection and lentiviral vectors were used to construct the recombinant plasmids and lentiviral vectors，which carried genes of Toxoplasma ROP16 and pEGFP fusion protein．RAW264．7 cells were subjected to transfection with the constructs individually．Then the expressions of the target gene，cellularmorphology and transfection efficiency were observed with fluorescencemicroscopy and flow cytometry．Results The transfection efficiency of the recombinant plasmids in RAW264．7 goes as follows：electroporation＞Fugene?HD＞Lipofectamine?3000＞Attractene．However，the plasmids-transfected host cells became vulnerable to deaths via electroporation．Comparatively，the high efficacy of 61．2%was achieved with lentivirus infection（P＜0．05）．In addition，statistic analyses showed that lentivirus infection of the host cells had obvious advantages over the tested plasmid vectors（P＜0．05）．ConclusionToxoplasma gondii ROP16 has been successfully transferred to RAW264．7 macrophages by lentivirus infection，which resultes in higher efficiency of tranfection and expression of Toxoplasma gondii ROP16 gene in the cells than those by plasmids．

Key wordsROP16 gene；RAW264．7；lentivirus infection