李保山，查小雪，朱德發(fā)，康冬梅

甲狀腺素聯(lián)合多奈哌齊對(duì)成年期甲狀腺功能減退癥大鼠海馬syntaxin-1的影響

李保山1，查小雪2，朱德發(fā)2，康冬梅1

摘要目的觀察甲狀腺素（T4）聯(lián)合多奈哌齊對(duì)成年期甲狀腺功能減退癥（甲減）大鼠的海馬內(nèi)突觸前膜相關(guān)蛋白1 （syntaxin-1）表達(dá)的影響，探討甲減腦損傷及可能的恢復(fù)機(jī)制。方法44只SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、甲減組、T4替代治療組及T4和多奈哌齊聯(lián)合治療組。通過(guò)飲水給予丙基硫氧嘧啶0．05%建立成年期大鼠甲減模型共6周。第5周開(kāi)始，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，T4替代治療組每日給予左旋甲狀腺素（L-T4）6μg／100 g體重（BW）腹腔注射，聯(lián)合治療組每日給予6μg／100g BW L-T4腹腔注射及飲用水中加入0．005%多奈哌齊。采用免疫組織化學(xué)法和Western blot法分析4組大鼠海馬syntaxin-1的表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組比較，甲減組大鼠血清三碘甲狀腺原氨酸（T3）、T4水平減低，促甲狀腺激素（TSH）水平升高（P＜0．01），海馬內(nèi)syntaxin-1在CA1、CA3各層及齒狀區(qū)多形層（DG-PL）表達(dá)顯著增加（P＜0．01）；T4替代治療后，血清T3、T4和TSH水平恢復(fù)至正常水平，syntaxin-1蛋白的表達(dá)未完全恢復(fù)到對(duì)照組水平（P＜0．05）；T4聯(lián)合多奈哌齊治療后syntaxin-1蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論T4聯(lián)合多奈哌齊治療可以修復(fù)成年期甲減導(dǎo)致的腦損傷。

關(guān)鍵詞甲狀腺功能減退癥；甲狀腺素；多奈哌齊；syntaxin-1；海馬

成年期甲狀腺功能減退癥（甲減）可引起廣泛的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和功能障礙，其機(jī)制可能與甲狀腺素（thyroxine，T4）的缺乏引起突觸可塑性改變有關(guān)［1］。突觸融合蛋白1（syntaxin-1）是特異性分布在神經(jīng)細(xì)胞突觸前膜上的蛋白，通過(guò)與SNAP-25和synaptobrevin／VAMP蛋白聚合，進(jìn)而形成被認(rèn)為是神經(jīng)突觸囊泡融合必要因子的SNARE核心復(fù)合體，與突觸可塑性有關(guān)［2］。海馬是負(fù)責(zé)認(rèn)知和學(xué)習(xí)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，主管空間記憶和事件記憶的形成。研究［3］顯示T4缺乏引起的認(rèn)知功能障礙可能與海馬內(nèi)的syntaxin-1水平升高有關(guān)，常規(guī)劑量的T4替代治療并不能使syntaxin-1水平完全恢復(fù)。該研究用丙硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）建立成年期大鼠甲減模型，旨在探討T4聯(lián)合多奈哌齊對(duì)成年期甲減大鼠海馬syntaxin-1表達(dá)水平的影響。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠44只，12周齡，普通級(jí)，體重260～300 g，南京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2主要儀器及試劑

三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、T4放射免疫試劑盒購(gòu)自北方生物技術(shù)研究所；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的兔抗山羊IgG購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的GAPDH單抗購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰荆簧窖蚩勾笫罂箂yntaxin-1蛋白多克隆抗體、DAB試劑盒、SP-022生物素標(biāo)記羊抗兔IgG超敏試劑盒均購(gòu)自北京博奧森公司；DFM 296型16管放射免疫γ計(jì)數(shù)器購(gòu)自合肥眾成機(jī)電技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；DXM 1200F光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司；JEDR801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；PTU、左旋甲狀腺素（L-T4）及多奈哌齊購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；VE-180垂直電泳槽、EPS-300電泳儀、VE-186轉(zhuǎn)膜電槽購(gòu)自上海天能科技有限公司。

1．3模型制備

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，每組11只：對(duì)照組、甲減組、T4替代治療組（T4組）、聯(lián)合治療組（T4＋多奈哌齊組），用 0．05% PTU飲水6周建立成年期大鼠甲減模型。第5周起，對(duì)照組予以等量生理鹽水腹腔注射；T4組每日腹腔注射6μg／100 g體重（body weight，BW）L-T4；T4＋多奈哌齊組每日腹腔注射6μg／100 g BW T4并在飲用水中加入0．005%多奈哌齊。治療時(shí)間為2周。

1．4標(biāo)本制備

血清制備：造模結(jié)束，稱重，水合氯

2015－05－07接收

230001

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年內(nèi)分泌科，合肥230022

腦標(biāo)本制備：取血結(jié)束將大鼠斷頭處死，冰上取腦組織，右腦置于4%多聚甲醛溶液中固定待做免疫組化染色，左腦分離出海馬組織后于－80℃冰箱保存待做Western blot檢測(cè)。

1．5甲狀腺激素水平測(cè)定

采用放射免疫法檢測(cè)血清T3、T4、TSH水平，檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書。

1．6免疫組化染色

采用超敏SP法行免疫組化檢測(cè)。通過(guò)光學(xué)顯微鏡拍攝海馬CA1、CA3和齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)，采用生物圖像分析系統(tǒng)對(duì)DG區(qū)的分子層（ML）和多形層（PL），CA1區(qū)的起始層（SO）、放射層（SR）和腔隙分子層（SLM），CA3區(qū)的SO層、透明細(xì)胞層（SL）和SR層的syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行光密度（optical density，OD）值分析，取其平均OD值。

1.7突觸小體提取及W estern blot法檢測(cè)

4℃

生理鹽水沖洗海馬組織，去除血液，濾紙拭干，玻璃勻漿器中勻漿，提取突觸小體后通過(guò)Western blot法檢測(cè)syntaxin-1蛋白，具體操作參照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行。分析條帶相對(duì)OD值，通過(guò)syntaxin-1與內(nèi)參GAPDH的條帶OD值的比值來(lái)間接反映syntaxin-1的表達(dá)量。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1大鼠血清T3、T4及TSH水平

與對(duì)照組比較，甲減組大鼠血清T3、T4水平顯著降低，而TSH水平則顯著升高（F＝8．765、33．264、26．809，P＜0．01）；T4組大鼠血清T3、T4及TSH水平恢復(fù)至正常水平（P＞0．05）；聯(lián)合治療組大鼠血清T3、T4及TSH水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表1。

表1　各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較（n＝11，±s）

表1　各組大鼠血清甲狀腺激素水平比較（n＝11，±s）

與對(duì)照組比較：**P＜0．01；與甲減組比較：＃P＜0．05，＃＃P＜0．01

組別　T3（nmol／L）　T4（nmol／L）　TSH（μIU／m l）0．81±0．02　48．88±1．12　1．05±0．12甲減　0．59±0．03**　19．08±1．67**19．68±3．03**T4　0．81±0．06＃?！?1．74±1．93＃＃　1．19±0．33＃＃T4＋多奈哌齊　0．75±0．07?！?2．81±1．94＃＃　1．04±0．13對(duì)照＃＃

2.2免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬各區(qū)syntaxin-1表達(dá)

右腦組織切片，可見(jiàn)海馬結(jié)構(gòu)清晰，染色較強(qiáng)（陽(yáng)性著色呈棕黃色）。光鏡下觀察，syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物分布在CA1、CA3和DG區(qū)各層，呈棕黃色顆粒，在甲減組中CA1、CA3所有層區(qū)和DG-ML層棕黃色顆粒更為密集，T4組的DG-ML層和DGPL層的syntaxin-1表達(dá)較對(duì)照組較高，而syntaxin-1表達(dá)水平在T4＋多奈哌齊聯(lián)合治療組與對(duì)照組基本相似。見(jiàn)圖1。

量化分析4組大鼠海馬內(nèi)CA1、CA3及DG區(qū)各層syntaxin-1免疫反應(yīng)產(chǎn)物的OD值，與對(duì)照組比較，甲減組海馬內(nèi)CA1、CA3各層及DG-PL層表達(dá)顯著增加（F＝9．279、7．182、7．423、5．202、5．060、4．014、2．250、3．139，P＜0．05）。T4組DG-ML和DG-PL層syntaxin-1的OD值仍大于對(duì)照組（F＝1．524、1．848，P＜0．05）。T4＋多奈哌齊聯(lián)合治療組各層syntaxin-1的OD值更接近于對(duì)照組（P＞0．05）。見(jiàn)表2。

與對(duì)照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01

2.3W estern b lot法檢測(cè)大鼠海馬syntaxin-1表達(dá)變化

甲減組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，為對(duì)照組的1．38倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；T4組和聯(lián)合治療組大鼠海馬內(nèi)syntaxin-1表達(dá)水平分別為對(duì)照組的1．29倍和1．17倍，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)圖2。

3　討論

本研究中，甲減組大鼠海馬突觸小體內(nèi)syntaxin-1表達(dá)與對(duì)照組比較明顯增加，與研究［3］結(jié)論基本一致。syntaxin-1蛋白是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要調(diào)節(jié)蛋白之一，研究［4－6］顯示甲減大鼠模型中不同的組織syntaxin-1表達(dá)水平不一致。PTU誘導(dǎo)的甲減大鼠的腦前額葉中內(nèi)syntaxin-1減少［4］，甲狀腺切除的甲減模型的腺垂體內(nèi)syntaxin-1表達(dá)也下調(diào)［5］，而垂體切除的甲減模型腎上腺內(nèi)syntaxin-1表達(dá)升高［6］。研究［7］表明甲減可以導(dǎo)致T4或甲狀腺激素受體（thyroid hormone receptor，TR）在不同的組織分布不同。提示syntaxin-1表達(dá)不一致可能與不同組織對(duì)甲狀腺激素缺乏的反應(yīng)性不同有關(guān)。

T4替代治療是臨床治療甲減的經(jīng)典方法，其標(biāo)準(zhǔn)是血清甲狀腺激素恢復(fù)至正常水平，對(duì)甲減腦損傷修復(fù)程度的研究［6，8］結(jié)論并不一致。研究［6］顯示常規(guī)T4替代治療后甲減導(dǎo)致的突觸相關(guān)蛋白未完全恢復(fù)至對(duì)照組水平，文獻(xiàn)［8］顯示常規(guī)T4替代治療后突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平完全恢復(fù)。本研究中T4組大鼠血清T3、T4及TSH水平恢復(fù)至正常水平，但是該T4水平下syntaxin-1表達(dá)未完全恢復(fù)至對(duì)照組水平。其原因可能是T4主要通過(guò)結(jié)合TRs發(fā)揮作用，與受體結(jié)合不夠有關(guān)。研究［9］顯示，在分別多次注射低劑量T3和單次注射大劑量T3后，TRs結(jié)合率分別是49%和86%。研究［10］顯示，與低劑量T4比較，大劑量T4能夠更有效的恢復(fù)樹(shù)突棘數(shù)量。因此，大劑量的T4替代治療可以增加TRs的結(jié)合率，從而發(fā)揮更大的生理效應(yīng)。

T4替代治療的同時(shí)加用多奈哌齊后，研究顯示syntaxin-1的表達(dá)恢復(fù)至對(duì)照組水平。本研究首次顯示這一現(xiàn)象，目前多奈哌齊作用機(jī)制尚不明確，研究［11］證明多奈哌齊對(duì)神經(jīng)退行性病變具有獨(dú)立的保護(hù)作用，能夠保護(hù)大腦皮層神經(jīng)元，增加神經(jīng)元樹(shù)突的長(zhǎng)度和數(shù)量，避免海馬線粒體損傷和延緩阿爾茲海默病海馬萎縮。另外，多奈哌齊也被證明可以有效保護(hù)Tau蛋白病模型大鼠海馬內(nèi)突觸相關(guān)蛋白和脊髓［12］。

綜上所述，成年期甲減導(dǎo)致海馬內(nèi)syntaxin-1表達(dá)水平明顯增加，T4替代治療可以改善syntaxin-1表達(dá)水平，T4＋多奈哌齊聯(lián)合治療能夠完全恢復(fù)。提示T4聯(lián)合多奈哌齊對(duì)甲減導(dǎo)致的腦損傷的治療更有價(jià)值。

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中圖分類號(hào)R 581．2；R 322．81；R 446．6-3；R 977．14

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1390－04

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272152）；安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：12010402134）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院老年內(nèi)分泌科，合肥

作者簡(jiǎn)介：李保山，男，碩士研究生；康冬梅，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：kangdongmei2006＠sina．com醛0．3 m l／100 g麻醉后打開(kāi)腹腔，采取腹主動(dòng)脈血，3 000 r／min離心10 min，取血清置于4℃冰箱保存待測(cè)T3、T4和促甲狀腺激素（thyroid stim ulating hormone，TSH）。

Effects of thyroxin and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adult ratswith hypothyroidism

Li Baoshan1，Zha Xiaoxue2，Zhu Defa2，et al
（Dept of Geriatrics Endocrinology，1The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230001；2The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo observe the effects of thyroxine（T4）and donepezil on hippocampal syntaxin-1 expression in adulthypothyroidism rats，and clarify the possiblemechanism under the hypothyroidism-induced cognitive dysfunction．MethodsThe Sprague-Dawley rats were randomly classified into four groups：normal control，hypothyroid（PTU：0．05%，add to the dringking water），hypothyroid receiving levothyroxine replacement therapy（6μg／100 g body weight once daily，ip injection），and a combination of both drugs（levothyroxine：6μg／100 g；donepezil 0．005%）．Serum T3，T4 and TSH concentrationswere obtained using a radioimmunoassay kit．Protein levels of syntaxin-1 were determined by immunohistochemistry and Western blot．ResultsCompared to the control，the serum T3 and T4 levels of the hypothyroid group rats were significantly decreased，serum TSH elevated，syntaxin-1 in the hippocampus was significantly increased in CA1，CA3 and DG-PL regions．After levothyroxine or combined with donepezil treatment，serum T3，T4 and TSH were returned to the normal．But treatmentwith levothyroxine alone failed to normalize the expression of syntaxin-1．The level of syntaxin-1 was restored completely to the control group．ConclusionOur findings suggest that adult-onset hypothyroidism may induce increment of syntaxin-1 in the hippocampus，which could be restored preferably by T4 combined with donepezil treatment．

Key wordshypothyroidism；thyroine；dozepezil；syntaxin-1；hippocampus