騰佳麗，劉彥君

IGF1對(duì)高糖下內(nèi)皮細(xì)胞增殖及移行的影響

騰佳麗，劉彥君

摘要目的觀察高糖下胰島素樣生長因子1（IGF1）對(duì)高糖下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖和移行的影響，并探討其可能影響機(jī)制。方法體外培養(yǎng)HUVEC，分為對(duì)照組、高糖組、高滲組、高糖＋I(xiàn)GF1組和高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測內(nèi)皮細(xì)胞增殖，Transwell小室觀察細(xì)胞移行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt）及叉頭轉(zhuǎn)錄因子1（FoxO1）的mRNA水平。免疫組化法測定內(nèi)皮細(xì)胞Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1的蛋白表達(dá)，并行半定量分析。結(jié)果與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞存活率、移行率明顯降低，F(xiàn)oxO1 mRNA表達(dá)明顯升高，F(xiàn)oxO1／p-FoxO1蛋白表達(dá)增加，Akt／p-Akt比值增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組細(xì)胞存活率、移行率明顯增加，F(xiàn)oxO1 mRNA的表達(dá)明顯降低，F(xiàn)oxO1／p-FoxO1蛋白表達(dá)降低，Akt／p-Akt蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組細(xì)胞存活率未見明顯差異，移行未增加，F(xiàn)oxO1 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0．05），F(xiàn)oxO1／p-FoxO1未見明顯差異。5組AktmRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IGF1能改善高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖移行的抑制作用，其機(jī)制可能是IGF1激活A(yù)kt進(jìn)一步調(diào)節(jié)FoxO1的表達(dá)。

關(guān)鍵詞IGF1；FoxO1；高糖；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；移行

研究［1］顯示糖尿病患者心腦血管病變及周圍血管閉塞的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)高于非糖尿病患者。研究［2］顯示高血糖與糖尿病血管病變有關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)可能繼發(fā)于高血糖。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）是細(xì)胞生長、分化和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子。研究［3］證明IGF1具有多種代謝和血管保護(hù)作用，從很多方面直接對(duì)抗內(nèi)皮功能失調(diào)，目前關(guān)于IGF1的報(bào)道［4］多關(guān)注其在神經(jīng)損傷方面的研究，在血管保護(hù)方面的報(bào)道較少，且機(jī)制不清。IGF1可激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）／絲氨酸－蘇氨酸蛋白激酶（serine／threonine kinase，Akt）通路，調(diào)控叉頭轉(zhuǎn)錄因子-1（forkhead transcription factor 1，F(xiàn)oxO1）表達(dá)［3］。高糖可能通過PI3K／Akt的解偶聯(lián)參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展［5］。該研究擬探討IGF1對(duì)高糖下內(nèi)皮細(xì)胞增殖及移行的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1．1主要材料與儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）獲贈(zèng)于中科院生物物理研究所（購自ATCC細(xì)胞庫），由解放軍306醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室保存，第2～5代的細(xì)胞用于本研究。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液（endothelial cell growth medium，EGM）（瑞士lonza公司）；含有EDTA的胰酶（美國Gibco公司）；D-葡萄糖粉、缺乏生長因子的IV型膠原纖維（美國Sigma公司）；RNAiso及Q-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；抗-Akt單克隆抗體、抗磷酸化特異性Thr308Akt單克隆抗體、抗-FoxO1單克隆抗體、抗磷酸化特異性Ser256 FoxO1單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體、免疫組化DAB發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Akt抑制劑（AZD5363，美國Selleck公司）；6、24、96孔板、24孔板Transwell小室（美國Corning公司）；PCR引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；AIRTECH超凈工作臺(tái)（天津鈞星瑞科技有限公司）；7500 Real Time PCR System（美國Applied biosystems公司）；一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀（SmartChemi，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；電子顯微鏡（ICC50 HD，德國LEICA公司）。

1．2方法

1．2．1HUVEC的培養(yǎng)

用EGM培養(yǎng)基（含2%進(jìn)口胎牛血清），在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，瓶底被細(xì)胞鋪滿80%時(shí)，用0．25%胰酶消化、傳代，取2～5代增殖旺盛的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為5組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照組（5 mmol／L葡萄糖）；高糖組（25 mmol／L葡萄糖）；高糖＋I(xiàn)GF1組（25 mmol／L葡萄糖＋80 ng／m l IGF1）；高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組（25

2015－04－29接收

1．2．2HUVEC增殖實(shí)驗(yàn)

將1×105個(gè)細(xì)胞／孔接種于0．1%IV型膠原纖維處理后的96孔板。無血清培養(yǎng)24 h后更換EGM培養(yǎng)液，按照不同方式分5組進(jìn)行干預(yù)，終體積為200μl／孔。培養(yǎng)48 h后，棄上清液，每孔依次加入EGM培養(yǎng)液和四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）溶液20μl（5 mg／ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO 150μl，置搖床室溫均勻震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀檢測波長490 nm處吸光度（absorbance，A）值。按照下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值×100%。

1．2．3Transwell小室檢測HUVEC遷移

將細(xì)胞按照5×105個(gè)細(xì)胞／孔接種于0．1%IV型膠原纖維處理后的24孔板，上室EGM培養(yǎng)液每孔500μl，下室為對(duì)照組、高糖組、高糖＋I(xiàn)GF1組、高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組和高滲組培養(yǎng)液各1．5 ml，培養(yǎng)12 h后取出上室，刮除膜上層內(nèi)皮細(xì)胞，10%甲醛溶液固定后結(jié)晶紫染色，于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取均值。計(jì)算遷移抑制率，遷移抑制率（%）＝（對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)－實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)）／對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1．2．4采用SYBR GreenⅠ染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Akt、FoxO1 mRNA表達(dá)

將5×105個(gè)細(xì)胞／m l接種于6孔培養(yǎng)板，按照對(duì)照組、高糖組、高糖＋I(xiàn)GF1組、高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組和高滲組培養(yǎng)48 h后，Trizol法提取5組細(xì)胞總RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的基因。PCR引物序列為FoxO1上游引物：5′-GGCTGAGGGTTAGTGAGCAG-3′；FoxO1下游引物：5′-AAGGGAGTTGGTGAAAGACATC-3′；Akt上游引物：5′-CTCATTCCAGACCCACGAC-3′；Akt下游引物：5′-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3′；β-actin上游引物：5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′；β-actin下游引物：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)熱變性30 s；兩步法PCR：95℃變性15 s；60℃退火34 s；擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；60℃延伸1 min。應(yīng)用7500 System Software分析軟件，檢測目的基因與內(nèi)參擴(kuò)增的Ct值，根據(jù)ΔΔCt＝ΔCt實(shí)驗(yàn)組－ΔCt對(duì)照組，計(jì)算ΔΔCt值，得到實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于對(duì)照組目的基因的表達(dá)量（relative quantity，RQ），RQ＝2－ΔΔCt，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1．2．5免疫組化法檢測細(xì)胞Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白表達(dá)

制備細(xì)胞爬片，培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，進(jìn)行免疫組化檢測。在高倍鏡下隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞并對(duì)每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分。將評(píng)分之和除以細(xì)胞數(shù)作為FoxO1蛋白表達(dá)強(qiáng)度，表達(dá)率（%）＝（實(shí)驗(yàn)組表達(dá)強(qiáng)度／對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)度）×100%。計(jì)算Akt／p-Akt、FoxO1／p-FoxO1蛋白的值。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1IGF1對(duì)高糖下HUVEC生存率的影響

MTT結(jié)果顯示，設(shè)對(duì)照組培養(yǎng)48 h時(shí)的HUVEC細(xì)胞存活率為100%，則高滲組HUVEC的細(xì)胞存活率為93．71%，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；高糖組細(xì)胞存活率為69．10%，明顯低于對(duì)照組（P＜0．05）。對(duì)照組細(xì)胞存活率與高滲組存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞存活率明顯降低（t＝6．48，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組細(xì)胞存活率明顯增加（t ＝2．90，P＜0．05）；高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組細(xì)胞存活率未見明顯改變（t＝0．28，P＞0．05）。見表1。

表1　5組細(xì)胞生長比較（n＝4ˉ±s）

表1　5組細(xì)胞生長比較（n＝4ˉ±s）

與對(duì)照組比較：*P＜0．05；與高糖組比較：＃P＜0．05

組別A值　細(xì)胞存活率（%）0．86±0．07 100高糖0．59±0．04*69．10±4．65高糖＋I(xiàn)GF1 0．71±0．07＃83．30±8．14高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363 0．60±0．01*69．77±1．16高滲對(duì)照0．80±0．04 93．71±4．65

2.2IGF1對(duì)高糖下HUVEC遷移的影響與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞遷移抑制率顯著增高（t＝5．27，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組的細(xì)胞遷移抑制率顯著降低（t＝7．21，P＜0．05）；高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組的細(xì)胞遷移抑制率未見明顯改變（t＝0．31，P＞0．05）。高滲組中HUVEC遷移數(shù)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0．12，P＞0．05）。見表2。

2.3IGF1對(duì)高糖下Ak t、FoxO1 m RNA表達(dá)的影響高糖組FoxO1 mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯降低（6．00±0．65 vs1．14±0．15，t＝12．62，P＜0．05）。與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組FoxO1 mRNA的表達(dá)量明顯增加（2．73±1．52 vs6．00±0．65，t＝3．42，P＜0．05），高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組FoxO1 mRNA的表達(dá)量明顯降低（2．97±1．04 vs 6．00±0．65，t＝4．27，P＜0．05）。5組AktmRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝0．39，P＞0．05）。見圖1。

表2　5組HUVEC細(xì)胞遷移的比較（n＝5±s）

表2　5組HUVEC細(xì)胞遷移的比較（n＝5±s）

與對(duì)照組比較：*P＜0．05；與高糖組比較：＃P＜0．05

組別　遷移數(shù)　遷移抑制率（%）45．8±12．4 0高糖16．0±2．3*65．1±5．02高糖＋I(xiàn)GF1 26．6±2．3＃41．9±5．02高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363 16．6±3．6*63．8±7．86高滲對(duì)照45．0±8．9 1．7±1．94

2.4IGF1對(duì)高糖下Akt、p-Akt、FoxO1和p-FoxO1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，高糖組的FoxO1／p-FoxO1比值升高（4．50±1．15 vs 1．08± 0．14，t＝5．10，P＜0．05）；與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組FoxO1／p-FoxO1比值降低（2．15±0．29 vs 4．50±1．15，t＝3．41，P＜0．05），高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組的FoxO1／p-FoxO1比值與高糖組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6．22±1．19 vs4．50±1．15，t＝1．81，P＞0．05），高滲組FoxO1／p-FoxO1比值與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1．10±0．08 vs 1．08±0．14，t＝0．25，P＞0．05）。與對(duì)照組比較，高糖組的Akt／p-Akt比值升高（3．95±1．12 vs1．03±0．07，t＝4．50，P＜0．05）；與高糖組比較，高糖＋I(xiàn)GF1組Akt／p-Akt比值降低（1．92±0．35 vs3．95±1．12，t＝2．99，P＜0．05），高糖＋I(xiàn)GF1＋AZD5363組的p-Akt未見表達(dá)，Akt／p-Akt比值接近正無窮，高滲組Akt／p-Akt比值與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1．12±0．06 vs 1．03±0．07，t＝1．71，P＞0．05）。見圖2。

3　討論

研究［6］表明，高糖可抑制細(xì)胞增殖，干擾細(xì)胞周期，誘發(fā)DNA損傷并可輕度加速細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致糖尿病血管病變的發(fā)生［7］。內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失調(diào)被認(rèn)為是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程中的重要始動(dòng)因素［8］。糖尿病因血管并發(fā)癥導(dǎo)致的致殘致死率逐年升高，可能與糖尿病患者血管形成側(cè)支循環(huán)的能力下降有關(guān)［9］。研究［10］表明，IGF1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有明確保護(hù)作用。本研究中結(jié)果顯示高糖對(duì)HUVEC增殖及移行有明顯的抑制作用，表明高糖具有細(xì)胞毒性作用；加入IGF1可明顯改善高糖的抑制作用。

內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的FoxO1蛋白可激活其下游的多種因子，加速細(xì)胞凋亡［10］。為探究IGF1是否通過影響Akt-FoxO1通路的Akt活性進(jìn)而調(diào)控FoxO1的表達(dá)，本研究在高糖＋I(xiàn)GF1基礎(chǔ)上進(jìn)一步加入Akt阻滯劑AZD5363后顯示FoxO1／p-FoxO1未降低反而增高，Akt活化受抑制，p-Akt未發(fā)現(xiàn)表達(dá)，此時(shí)Akt／p-Akt無意義。其原因可能是在加入Akt阻滯劑后PI3K／Akt活化減弱，F(xiàn)oxO1去磷酸化，重新轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核內(nèi)，去磷酸化的FoxO1在核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖移行功能。研究［11］表明PI3K-Akt-FoxO1信號(hào)通路在血管生成及內(nèi)皮細(xì)胞生長與存活中發(fā)揮重要作用。IGF1可激活PI3K／Akt，活化的Akt可使FoxO1發(fā)生磷酸化而發(fā)生核輸出，由核內(nèi)轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)中，失去轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制細(xì)胞的凋亡［12］。本研究的結(jié)果與報(bào)道［12－13］一致，說明IGF1是通過Akt-FoxO1通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及移行的功能。為高糖下因FoxO1高表達(dá)所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能受損提供了直接依據(jù)。提示IGF1保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用是通過調(diào)控FoxO1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果顯示，高糖抑制FoxO1 mRNA水平的表達(dá)，但在蛋白表達(dá)水平上FoxO1／p-FoxO1比值增高，說明高糖抑制了FoxO1的磷酸化。IGF1使高糖下FoxO1 mRNA的表達(dá)量明顯增加，高糖＋I(xiàn)GF1 ＋AZD5363后FoxO1 mRNA的表達(dá)量明顯降低，但FoxO1／p-FxoO1比值顯著升高，可能是其他信號(hào)通路對(duì)FoxO1蛋白表達(dá)的影響，具體信號(hào)通路機(jī)制有待進(jìn)一步研究。5組中AktmRNA的表達(dá)未發(fā)現(xiàn)明顯變化，可能是IGF1對(duì)Akt的調(diào)節(jié)作用主要體現(xiàn)在蛋白表達(dá)水平。

本研究顯示高滲組對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果未產(chǎn)生影響，排除高糖處理下的高滲狀態(tài)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。本研究推測IGF1是通過激活A(yù)kt影響下游FoxO1／p-FoxO1水平進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及移行達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮的作用，IGF1對(duì)減緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。FoxO蛋白在血管病變發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制目前尚不清楚，進(jìn)一步研究需通過核實(shí)動(dòng)物模型來探索FoxO在體內(nèi)變化的病理生理學(xué)意義，加強(qiáng)對(duì)糖尿病血管病變發(fā)病機(jī)制的探討，為糖尿病血管病變的防治做出更大貢獻(xiàn)。

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中圖分類號(hào)R 587．1；R 587．2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1373－05

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：21331001）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍第306臨床學(xué)院內(nèi)分泌科，北京100101

作者簡介：騰佳麗，女，碩士研究生；劉彥君，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：liuyanj＠yeah．netmmol／L葡萄糖＋80 ng／ml IGF1＋5μmol／L AZD5363）；高滲組（20 mmol／L甘露醇＋5 mmol／L葡萄糖）。

Effects of IGF1 on proliferation and m igration of endothelial cells on high glucose

Teng Jiali，Liu Yanjun
（Dept of Endocrinology，306 Teaching Hospital of Anhui Medical University，Beijing100101）

AbstractObjectiveTo investigate the effects and the possiblemechanism of insulin like growth factor-1（IGF1）on proliferation and migration of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）in high glucose．Methods Cultured HUVEC were divided into 5 groups（control group，high glucose group，hypertonic group，high glucose＋I(xiàn)GF 1 group，high glucose＋I(xiàn)GF1＋AZD5363 group）．The proliferation was detected bymethyl thiazolyl tetrazolium（MTT），themigration was detected by transwellchamber．ThemRNA expressions of serine／threonine kinase（Akt）and FoxO1 were detected by real-time PCR．The protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere detected by immunohistochemisty．Resu ltsCompared with the control group，the rate of cell survival in high glucose group decreased significantly（P＜0．05），the transitional was decreased significantly（P＜0．05），the mRNA expression of FoxO1 was increased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere increased．Compared with high glucose group，the cell survival rate and migration rate in high glucose＋I(xiàn)GF1 group were increased significantly，the mRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressions of FoxO1／p-FoxO1 and Akt／p-Aktwere decreased．Compared with high glucose group，the cell survival rate andmigration rate in high glucose＋I(xiàn)GF1＋AZD5363 group had no significant difference，themRNA expression of FoxO1 was decreased significantly（P＜0．05），the protein expressionsof FoxO1／p-FoxO1 had no significant difference．ThemRNA expression of Akt in five groups had no significant difference．ConclusionIGF1 can improve the proliferation andmigration of endothelial cell in high glucose．It shows that IGF1 acts through Akt to promote FoxO1 phosphorylation．

Key wordsinsulin-like growth factor 1；forkhead transcription factors；high glucose；endothelia cells；proliferation；migration