薛 軍，武雪亮，高曉斌，王立坤，屈 明，郭 飛，張鵬程，楊瑞敏，袁美錦

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.血管腺體外科; 2.肝膽外科; 3.超聲醫(yī)學(xué)科; 4.護(hù)理部, 河北 張家口 075000)

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研究論文

結(jié)直腸腺癌組織survivin和Ki- 67的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

薛 軍1*，武雪亮1，高曉斌2，王立坤3，屈 明1，郭 飛1，張鵬程1，楊瑞敏3，袁美錦4

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.血管腺體外科; 2.肝膽外科; 3.超聲醫(yī)學(xué)科; 4.護(hù)理部, 河北 張家口 075000)

目的探究存活蛋白(survivin)和Ki- 67在結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。方法用免疫組化SP法和原位雜交法檢測survivin和Ki- 67蛋白在30例正常結(jié)直腸組織、60例結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)水平，分析survivin和Ki- 67與病理參數(shù)及結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果60例結(jié)直腸癌組織中survivin和Ki- 67蛋白陽性表達(dá)分別為73.34%(44/60)和80.00%(48/60)，顯著高于30例癌旁正常組織中的10.00%(3/30)和6.67%(2/30)，(P<0.01)；survivin mRNA在結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織中陽性表達(dá)分別為76.67%、6.67%；survivin和Ki- 67在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。Survivin、Ki- 67的表達(dá)與結(jié)直腸癌的TNM分期、腸壁侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹腔微轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)(P<0.05)。survivin和Ki- 67陽性表達(dá)患者1、3和5年生存率較低。survivin、Ki- 67、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹腔微轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。結(jié)論Survivin和Ki- 67的異常表達(dá)與結(jié)直腸腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其有望成為結(jié)直腸癌診療的新靶點。

結(jié)直腸癌；survivin；Ki- 67；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

目前，中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率呈明顯上升趨勢，且發(fā)病年齡日趨年輕化[1]。研究認(rèn)為，結(jié)直腸癌的發(fā)生與癌基因的激活和抑癌基因失活、細(xì)胞的凋亡受抑密切相關(guān)。Survivin是迄今發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的凋亡抑制因子，通過死亡受體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑有效抑制細(xì)胞凋亡[2]。本研究應(yīng)用免疫組化SP法、原位雜交法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中survivin的表達(dá)，評估其診斷價值，同時檢測反應(yīng)腫瘤增殖活性的Ki- 67的表達(dá)，觀察其與臨床病理參數(shù)間及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2011年7月至2013年7月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體外科手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織60例和30例癌旁正常組織，癌組織取自癌灶中心處，另取標(biāo)本殘端切緣經(jīng)病理證實為正常腸組織。全部病例都是原發(fā)性腫瘤，且術(shù)前未行新輔助放化療及免疫治療。其中38例男性, 22例女性, 年齡38～78歲(平均57±2)歲；正常結(jié)直腸組織中, 19例男性, 11例女性, 年齡38～78歲(平均56±2)歲，二組一般資料無差異，該實驗方案獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)并保持全程跟蹤，入選對象均簽知情同意書。

1.2 免疫組化.原位雜交試劑和方法

兔抗人單克隆濃縮型survivin抗體(克隆號ab3517 R1-5G3)、Ki- 67單克隆抗體(Abcam公司)、survivin mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，survivin靶基因的mRNA序列為:5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACCACCGCA-3′；5′-A AGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCT-3′；5-AGA AAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCTGG-3′，按試劑盒說明書操作。

免疫組化方法：標(biāo)本固定，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，HE染色，鏡下閱片病理診斷，切片經(jīng)過80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù)；PBS洗3次，加一抗，4 ℃過夜；PBS洗3次，加二抗。室溫下使用DAB顯色試劑顯色，蘇木精輕度復(fù)染，并用1%的鹽酸乙醇分化5 min、流水沖5 min、梯度乙醇脫水(80%、85%、90%、95%、100%)及松節(jié)油透明5 min，最后樹膠封片。陰性對照為PBS代替一抗。

原位雜交方法：切片厚度4 μm，常規(guī)脫蠟、水化；3% H2O2室溫孵育15 min，滅活內(nèi)源性過氧化酶活性，暴露mRNA核酸片段：滴加胃蛋白酶37 ℃消化；預(yù)雜交：滴加15μL預(yù)雜交液，置恒溫箱42 ℃，3 h；再次滴加15 μL雜交液，置恒溫箱38 ℃雜交過夜；洗滌；滴加封閉液：37 ℃，30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛；滴加SABC；滴加生物素化過氧化物酶；37 ℃，20 min。DAB顯色，顯色20 min。充分水洗；蘇木素復(fù)染，二甲苯透明后中性樹膠封片。陰性對照為不加探針和RNA酶處理的切片。

1.3 陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)果判定參考Soong等[3]的方法，survivin、Ki- 67分別定位于胞質(zhì)和細(xì)胞核，以黃色或黃褐色顆粒為陽性表達(dá)，計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)并賦予分值,≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>7 5%為4分；觀察著色強(qiáng)度并賦予分值，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分。兩者相乘，0分為(-) ，1～4分為(+) ，5～8分為(++)，9～12分為(+++)，(+)～(+++)均視為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料以百分率表示，兩組相比采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearmen檢驗，多因素預(yù)后分析采用回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 Survivin和Ki- 67在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)

Survivin、survivin mRNA在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)；Ki- 67在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，(P<0.05)；survivin、Ki- 67蛋白表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的TNM分期、腸壁侵潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹腔微轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，其陽性率在TNMⅠ、Ⅱ期低于Ⅲ、Ⅳ期(P<0.05)(圖1,2，表1)。

A.positive expression of survivin in normal colorectal tissues; B.positive expression of survivin in colorectal adenocarcinoma tissues; C.positive expression of Ki- 67 in normal colorectal tissues; D.positive expression of Ki- 67 in colorectal adenocarcinoma tissues

圖1 免疫組化檢測survivin和Ki- 67 在結(jié)直腸正常組織和腺癌組織中的表達(dá)

Fig 1 Expressions of survivin and Ki- 67 in colorectal normal tissues and colorectal adenocarcinoma tissues detectedby immunohistochemistry(SP× 400)

A.positive expression of survivin mRNA in normal colorectal tissues; B.positive expression of survivin mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues; C.positive expression of Ki- 67 mRNA in normal colorectal tissues; D.positive expression of Ki- 67 mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues

圖2 原位雜交檢測survivin 和Ki- 67 mRNA在結(jié)直腸正常組織和腺癌組織中的表達(dá)

*P<0.01 compared wtih normal tissues.

2.2 Survivin與Ki- 67蛋白表達(dá)的相關(guān)性

結(jié)直腸癌組織中survivin與Ki- 67蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.641，P<0.05)，隨著survivin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Ki- 67蛋白表達(dá)率亦增高(表2)。

2.3 結(jié)直腸癌患者預(yù)后的危險因素分析

Survivin、Ki- 67、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和腹腔微轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05)(表3)。

表2 結(jié)直腸癌組織中survivin和Ki- 67 表達(dá)的相關(guān)性

*P<0.01 compared with Ki- 67.

表3 Survivin 和Ki- 67 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

*P<0.05,**P<0.01 compared with pathological index.

2.4 Survivin與Ki- 67蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

隨著survivin、Ki- 67表達(dá)程度增加，中位生存時間縮短，survivin三組比較1、3和5年生存率均有差異(P<0.05)；Ki- 67三組比較1、3和5年生存率有差異(P<0.05)(表4,5)。

表5 Ki- 67蛋白表達(dá)對結(jié)直腸癌術(shù)后生存時間和生存率的影響

3 討論

Survivin基因定位于17q25，內(nèi)含142個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為165 ku，是抗凋亡活性最強(qiáng)的一種癌基因[4]。Survivin蛋白是由單個N端桿狀病毒重復(fù)序列(baculovirus IAP repeat,BIR)、長的C端alpha螺旋區(qū)組成的二聚體結(jié)構(gòu)，其中BIR結(jié)構(gòu)能特異性地結(jié)合多種細(xì)胞信號蛋白(G蛋白亞單位、Src、Fyn和HA2Ras等)，發(fā)揮抑制凋亡作用[5]。Survivin基因結(jié)構(gòu)高度保守，其啟動子在正常細(xì)胞中基本處于休眠狀態(tài)，僅在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，且具有周期依賴性，集中于G2/M期，因而除在胚胎期組織、胸腺組織、分泌期子宮內(nèi)膜組織中微表達(dá)外，在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌等絕大多數(shù)惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[6]。

Survivin抗凋亡的機(jī)制主要有：1)直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶cspase- 3和cspase- 7的活性，2)與周期蛋白激酶CDK4、CDK2相互作用形成survivin-CDK4、survivin-CDK2復(fù)合體間接抑制cspase- 3，中斷凋亡信號傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞凋亡[7]；此外,survivin能夠通過與紡錘體微管發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞周期監(jiān)測點的監(jiān)視,致腫瘤細(xì)胞異常分裂繁殖[8]。Survivin除抑制細(xì)胞凋亡外，還能夠在調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成、腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生及腫瘤細(xì)胞的浸潤、遷徙等過程中發(fā)揮重要作用[9]。

Ki- 67抗原屬于細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，在G0期以外的所有細(xì)胞周期均有不同程度表達(dá)，因而被用于評估乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖活性[10]。

本組實驗表明survivin蛋白高表達(dá)狀態(tài)可能與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生、浸潤、肝轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，這與報道[11- 12]基本一致，原因可能是survivin的異常表達(dá)可使細(xì)胞克服G2/M期的凋亡調(diào)控點而誘導(dǎo)細(xì)胞異常分裂，從而抑制細(xì)胞凋亡[13- 14]。結(jié)直腸腺癌組織中survivin與Ki- 67的表達(dá)呈正相關(guān)，均呈升高趨勢，提示survivin的過量表達(dá)使腫瘤細(xì)胞異常增殖，二者協(xié)同增加了抗凋亡作用，致腫瘤細(xì)胞凋亡缺陷、異常增殖，然而具體機(jī)制還需更進(jìn)一步研究。隨著survivin、Ki- 67表達(dá)指數(shù)的增強(qiáng)，其中位生存期和生存率逐步降低，也說明survivin、Ki- 67在評價結(jié)直腸癌患者預(yù)后方面有重要參考價值。

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Expression of survivin and Ki- 67in colorectal adenocarcinoma and its clinical significance

XUE Jun1*, WU Xue-liang1, GAO Xiao-bin2, WANG Li-kun3, QU Ming1, GUO Fei1,ZHANG Peng-cheng1, YANG Rui-min3, YUAN Mei-jin4

(1.Dept. of Vascular Gland; 2.Dept. of Hepatobiliary; 3.Dept. of Ultrasound; 4.Dept. of Nursing,the First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

Objective To investigate the expressions of survivin and Ki- 67 in the colorectal adenocarcinoma and its clinical significance. Methods The expressions of survivin and Ki- 67 in 60 specimens of coloreetal adenocarcinoma tissues and 30 specimens of normal eolorectal tissues were detected using Immunohistochemical SP technique and in situ hybridization. Results The positive expression rates of survivin and Ki- 67 in colorectal adenoeareinoma tissues were 73.34%and 80.00%,respectively,while in normal colorectal tissues they were 10.00% and 6.67%.The difference was significant (P<0.01). The positive expression rates of survivin mRNA in colorectal adenoeareinoma and normal tissues were 10.00% and 6.67%. Expression of survivin was positively related with expression of Ki- 67 in coloreetal adenocarcinoma tissues(P<0.05).Expression level of survivin and Ki- 67 was correlated with the TNM staging,liver metastasis,the depth of tumor invasion,lymph node metastasis,and peritoneal micrometastasis(P<0.05).The patients with positive expression of survivin and Ki- 67 had poor progosis with lower one,three,and five year survival rates.survivin,Ki- 67,the TNM staging,liver metastasis,lymph node metastasis, and peritoneal micrometastasis were independent prognosis factors for coloreetal adenocarcinoma. Conclusions Thethe high expression of survivin and Ki- 67 have a significant correlation with the initiation and progression of colorectal adenocarcinoma, and they may be amolecular-biological indicators in predicting the progress and prognosis of colorectal carcinoma.

colorectal carcinoma; survivin; Ki- 67; immunohistochemistry; progosis

2015- 06- 11

2015- 08- 16

河北北方學(xué)院校級重大項目(ZD201310);河北省衛(wèi)計委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題計劃(20150058); 河北北方學(xué)院創(chuàng)新人才項目(CXRC1325);張家口市科技局指令性計劃(1311055D)

1001-6325(2015)11-1526-05

R 735.34

A

*通信作者(corresponding author)：yfywlkwxl@126.com