胡紅衛(wèi)，熊晶晶，趙 川，遠(yuǎn)孟夢，魏 來，劉 梅，黃永坤*，趙亞玲，丁臻博

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.兒科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)

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潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸緊密連接occludin蛋白表達(dá)降低及藥物的影響

胡紅衛(wèi)1#，熊晶晶1#，趙 川2，遠(yuǎn)孟夢1，魏 來1，劉 梅1，黃永坤1*，趙亞玲1，丁臻博1

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.兒科； 2.病理科， 云南 昆明 650032)

炎癥性腸病是慢性且易反復(fù)發(fā)作的胃腸道病癥，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。Occludin蛋白是腸緊密連接中最重要的蛋白質(zhì)分子之一，表達(dá)上調(diào)，可以減少腸上皮受損，保護(hù)腸黏膜上皮間的緊密連接蛋白，降低腸道通透性[1]。美沙拉秦因其療效好及不良反應(yīng)較少而作為潰瘍性結(jié)腸炎的一線治療藥，但仍可見其不良反應(yīng)。蒙脫石散是良好的腸黏膜保護(hù)劑，參與腸黏膜的直接修復(fù)作用。本研究測定腸緊密連接occludin蛋白，擬評價(jià)美沙拉秦和蒙脫石散單獨(dú)或聯(lián)合治療TNBS/乙醇誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜變化，以深入認(rèn)識腸黏膜屏障損傷和修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對象:50只清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量160～180 g，6～8周[昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號：SYSK(滇)2011- 0004)]。

1.2 主要試劑:2- 4- 6三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma公司)，美沙拉秦腸溶片(Losan Pharma.GmbH公司)，蒙脫石散(規(guī)格3 g/袋，博福-益普生公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(天根生化公司)；兔抗大鼠occludin抗體(Abcam公司)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模:將大鼠隨機(jī)分為對照組(A組)、模型組(B組)、美沙拉秦組(C組)、蒙脫石散組(D組)和美沙拉秦聯(lián)合蒙脫石散組(E組)，每組n=10。參照文獻(xiàn)[2]造模。造模滿24 h隨機(jī)抽取1～2只大鼠行解剖及光電鏡檢查證實(shí)造模成功。根據(jù)人和大鼠體表面積換算公式予各組相應(yīng)的藥物劑量，模型組給予0.9%氯化鈉溶液2 mL。

1.3.2 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評分:造模滿24 h開始每天觀察并記錄大鼠的精神、體質(zhì)量和大便情況。

1.3.3 標(biāo)本采集:治療滿12 d時(shí)取病變最明顯處腸組織，一部分行HE染色及免疫組織化學(xué)法檢測腸緊密連接occludin蛋白的表達(dá)。另一部分行實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腸緊密連接occludin-mRNA的表達(dá)。

1.3.4 結(jié)腸組織病理學(xué)評價(jià):行HE染色的結(jié)腸組織于光鏡和電鏡下觀察病理改變。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色檢測腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin:采用Elivision法檢測腸緊密連接occludin蛋白。高倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野，參照Fromowitz半定量分級方法對組織評分。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin-mRNA，occludin引物序列：上游5′-CGGGCTACCTTATTGAA TGTCC-3′，下游5′-GAGCGAACTGAATGGTCTGATG-3′；按照試劑盒說明進(jìn)行RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取1 μL cDNA用于反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 31 s，45個(gè)循環(huán)數(shù)。以大鼠GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用2-△△ct法進(jìn)行計(jì)算，每次每個(gè)樣本重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 模型建立成功:造模滿24 h，大鼠死亡1只。余大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，腹瀉和黏液血便。DAI評分為2.6～3分。在光鏡和電鏡下造模滿24 h大鼠結(jié)腸黏膜層缺血、壞死，潰瘍形成面積大，黏膜下層水腫，腺體結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細(xì)胞減少。模型建立成功(圖1，2)。

2.2 治療12 d以后免疫組化結(jié)果及real time PCR結(jié)果

3 討論

Occludin蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的定位于緊密連接的跨膜蛋白， 在腸緊密連接屏障中發(fā)揮重要作用。腸occludin蛋白表達(dá)的降低是導(dǎo)致腸上皮緊密連接通透性增加的重要機(jī)制[3]。在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠中，腸occludin蛋白表達(dá)明顯降低。蒙脫石散有直接修復(fù)腸黏膜的作用，由此聯(lián)合使用美沙拉秦和蒙脫石散治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥使occludin蛋白的表達(dá)較單獨(dú)使用明顯升高。其可能機(jī)制一方面是由于美沙拉秦作為非特異性抗炎藥減弱了相應(yīng)的炎性因子所激活的免疫反應(yīng)。但同時(shí)美沙拉秦作為抗炎藥單純發(fā)揮抑制炎性反應(yīng)的作用，而不能有效改善腸內(nèi)觸發(fā)炎性反應(yīng)的微環(huán)境。蒙脫石散有效覆蓋在腸黏膜上，發(fā)揮直接修復(fù)腸黏膜的作用，同時(shí)吸附有害毒素，減少抗原物質(zhì)對細(xì)胞膜表面Toll樣受體及NOD樣受體的刺激，抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活化而下調(diào)促炎因子。綜上美沙拉秦聯(lián)合蒙脫石散治療UC時(shí)，發(fā)揮了保護(hù)和促進(jìn)腸黏膜修復(fù)的效果。

圖1 對照組和模型組光鏡組織嗜伊紅染色Fig 1 Light microscope HE of control and model group(×80)

圖2 對照組和模型組電鏡的組織結(jié)構(gòu)Fig 2 Electric microscope histological structures of control and model group

groupoccludin-mRNA/(×10-4)occludinproteinA8.97±4.330.72±0.17#B6.79±1.350.26±0.20*C17.64±4.83*#0.40±0.26*D13.74±2.61*#0.34±0.17*E28.76±4.50*#0.78±0.14#

*P<0.05 compared with A group；#P<0.05 compared with B group.

[1] 張文遠(yuǎn),姜偉煒.白頭翁醇提物對大鼠結(jié)腸炎腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的保護(hù)作用[J].世界華人消化雜志,2009,17:3134- 3139.

[2] 孫曉萍,候麗娟,王曉紅,等.大鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型的建立及操作規(guī)范探討[J].天津中醫(yī)藥2012,29:270- 273.

[3] Rana AS,Khaldun K,Guo SH,etal.Occludin regulates macromolecule flux across the intestinal epithelial tight junction barrier[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2011,300:G1054-G1064.

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“十二五”云南省特色學(xué)科群建設(shè)項(xiàng)目(201109)；益普生腹瀉基金(IDF- 2012- 01)

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