關(guān) 巍，崔金霞，時(shí)瑩慶，王 晉，馮喜英，格日力

(1.青海大學(xué) 高原醫(yī)學(xué)研究中心， 青海 西寧 810001； 2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科， 青海 西寧 810001；3.武警青海總隊(duì)醫(yī)院， 青海 西寧 810000)

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慢性高原病大鼠肺組織損傷加重及casepase- 3和相關(guān)因子的變化

關(guān) 巍1,2，崔金霞2，時(shí)瑩慶2，王 晉3，馮喜英2，格日力1*

(1.青海大學(xué) 高原醫(yī)學(xué)研究中心， 青海 西寧 810001； 2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科， 青海 西寧 810001；3.武警青?？傟?duì)醫(yī)院， 青海 西寧 810000)

慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道CMS患者肺彌散功能下降或通氣和彌散功能均下降[1]。目前對(duì)CMS肺組織結(jié)構(gòu)的變化研究很少。本研究觀察CMS大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的病理改變、肺組織內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(casepase- 3)及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)內(nèi)相關(guān)炎性因子的變化。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑:清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(148±5.2)g，鼠齡6周 [蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)：SCXK(甘)2011- 0001]；casepase- 3多克隆抗體、抗兔二抗和免疫組化試劑盒(上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素- 6(IL- 6)和IL- 10 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型及分組:將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和CMS組，每組10只。對(duì)照組飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，海拔2 260 m；CMS組飼養(yǎng)于青海高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙，模擬海拔5 500 m，常規(guī)喂食，31 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 標(biāo)本處理:取腹主動(dòng)脈血液2 mL，測(cè)定血常規(guī)。分離氣管，夾閉左主支氣管，插導(dǎo)管至右主支氣管，0.9%氯化鈉溶液灌洗右肺，收集BALF，雙層紗布過(guò)濾，離心，上清液-20 ℃冰箱保存，沉淀物涂片，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。左、右心房各開(kāi)1 cm小口，右房開(kāi)口插入導(dǎo)管，0.9%氯化鈉溶液以20 cm H2O壓力，10 mL/分鐘的速度滴注至肺葉變白，4%甲醛溶液灌洗雙肺，至肺葉變硬、肺緣銳利，分離右肺制作石蠟切片，HE染色檢查組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)casepase- 3。

1.2.3 標(biāo)本的測(cè)定項(xiàng)目:

1)大鼠肺組織形態(tài)定量分析：平均內(nèi)襯間隔(mean linear intercept，MLI)和肺泡破壞指數(shù)(destructive index，DI)：Mshot Digital Imaging System V1.0軟件系統(tǒng)，光學(xué)顯微鏡(×100)計(jì)數(shù)。單個(gè)肺泡面積(area of pulmonary alveoli, APA)和單位面積肺泡數(shù)(density of pulmonary alveoli, DPA)：江蘇省捷達(dá)科技8.0圖像分析系統(tǒng)得出結(jié)果。

2)免疫組化法測(cè)肺組織casepase- 3：肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，按免疫組化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

3)ELISA法測(cè)BALF中TNF-α、IL- 6和IL- 10濃度：按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

4)計(jì)數(shù)BALF中白細(xì)胞及各組分： BALF沉淀物涂片巴氏染色，低倍鏡觀察，行白細(xì)胞總數(shù)及各組分計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 血常規(guī)比較:CMS組的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白及紅細(xì)胞壓積顯著高于對(duì)照組(表1)，CMS建模成功。

2.2 光鏡下肺組織病理及MLI、DI、APA和DAP的比較:光鏡下可見(jiàn)CMS組部分肺泡破裂及肺泡腔擴(kuò)大。CMS組的MLI、DI和APA明顯高于對(duì)照組(P<0.001)，DAP明顯低于對(duì)照組(P<0.001)(表1)。

2.3 BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及TNF-α、IL- 6和IL- 10水平比較: CMS組與對(duì)照組相比，BALF中白細(xì)胞總數(shù)及巨噬細(xì)胞比例明顯增高(均P<0.001)，TNF-α、IL- 6顯著增高(均P<0.001)，IL- 10無(wú)顯著變化(表2)。

2.4 肺組織casepase- 3表達(dá)及陽(yáng)性率變化:CMS組casepase- 3細(xì)胞陽(yáng)性率(10.75±0.96)%顯著高于對(duì)照組(3.79±1.09)% (P<0.001)，casepase- 3陽(yáng)性在CMS組明顯增加(圖1)。

3 討論

CMS以紅細(xì)胞增多及顯著低氧血癥為特征。目前認(rèn)為環(huán)境低氧是CMS 低氧血癥的主要原因。但有報(bào)道CMS 患者的肺彌散功能、通氣功能有不同程度的下降[1]。高原紅細(xì)胞增多癥患者尸檢發(fā)現(xiàn)[2]，肺臟散在性出血，肺毛細(xì)血管高度擴(kuò)張淤血，肺泡壁增厚，彈力纖維增多，增粗，肺泡腔擴(kuò)大或有間質(zhì)性水腫，間質(zhì)小血管彈力纖維明顯增多。

表1 CMS組和對(duì)照組血常規(guī)和MLI、DI、APA和DAP比較Table 1 The comparison of blood routine test and MLI, DI, APA and DAP in CMS group and control group (±s, n=10)

*P<0.001 compared with control group; RBC.red blood cell; HB.hemoglobin; HCT.hematokrit.

表2 CMS組和對(duì)照組BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和TNF-α、IL- 6和IL- 10水平比較Table 2 The comparison of white cell count and TNF-α, IL- 6 and IL- 10 in CMS group and control group(±s, n=10)

*P<0.001 compared with control group.

圖1 肺組織casepase- 3 表達(dá)Fig 1 Casepase- 3 expression in lung tissue(×400)

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在模擬5 000 m的低壓氧艙30 d后，紅細(xì)胞及血紅蛋白明顯增加，肺泡破壞增加，肺泡腔增大，單位面積肺泡數(shù)減少。

肺泡巨噬細(xì)胞合成、分泌TNF-α、IL- 1、IL- 6和IL- 8等，在肺部防御和疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。TNF-α促進(jìn)多形核白細(xì)胞的聚集、黏附和滲出，釋放溶酶體酶、 彈性蛋白酶以及活性氧、 超氧離子, 損害肺泡上皮細(xì)胞。IL- 6與全身性炎性反應(yīng)和肺功能的下降程度有直接關(guān)系。IL- 10幾乎抑制所有促炎細(xì)胞因子的合成與釋放，因而具有抗感染作用?

本研究發(fā)現(xiàn)，BALF中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)量以及TNF-α、IL- 6水平較對(duì)照組明顯升高，說(shuō)明CMS大鼠肺組織炎性反應(yīng)加重。

有研究顯示肺內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡與肺損傷相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，CMS大鼠肺組織內(nèi)促炎因子及凋亡增加，casepase- 3陽(yáng)性率增高，肺組織破壞增加，提示CMS肺組織損傷，可能是加重CMS患者低氧的重要因素。

[1] 楊彩玲. 30例高原紅細(xì)胞增多癥患者肺功能變化及分析[J]. 高原醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20: 18- 19

[2] 鄒恂達(dá), 王旺強(qiáng), 王鹿朝. 高原紅細(xì)胞增多癥的病理觀察[J]. 高原醫(yī)學(xué)雜志, 1994, 2: 29- 32.

[3] Alber A, Howie SE, Wallace WA,etal. The role of macrophages in healing the wounded lung [J]. Int J Exp Pathol, 2012, 93: 243- 251.

[4] Perl M, Chung CS, Perl U,etal. Therapeutic accessibility of casepase- mediated cell death as a key pathomechanism in indirect acute lung injury [J]. Crit Care Med, 2010, 38: 1179- 1186.

2015- 03- 13

2015- 05- 27

1001-6325(2015)11-1542-02

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*通信作者(corresponding author)：weiguan110@163.com