范卓文，姚 莉，謝 明，李 龍，陳忠新，孫建華

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，哈爾濱150040;2.哈藥集團(tuán)中藥二廠，哈爾濱150078;3.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，哈爾濱150010)

中藥龍膽為龍膽科植物龍膽、三花龍膽或堅(jiān)龍膽等的干燥根及根莖，主要分布在黑龍江、遼寧、吉林、貴州、云南等地[1－2].龍膽性味苦、大寒、無(wú)毒，具有瀉下焦郁火、清肝膽濕熱之功效，常用于濕疹瘙癢、帶下、陰腫陰癢、耳鳴、脅痛等癥狀[3].現(xiàn)代研究表明龍膽中含有黃酮類(lèi)、多糖環(huán)烯醚萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酸、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分，其中多糖環(huán)烯醚萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)為其主要活性成分[4].對(duì)龍膽的指紋圖譜研究的報(bào)道已有很多，但是對(duì)龍膽的不同產(chǎn)地指紋圖譜的研究甚少[5－6].本實(shí)驗(yàn)建立了龍膽高效液相指紋圖譜的色譜條件，并對(duì)東北三省不同產(chǎn)地的龍膽進(jìn)行研究.

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

島津LC－2010AHT高效液相色譜儀(日本島津公司)，F(xiàn)A2004型電子天平(上海良平儀器代表有限公司)，KQ－500型超聲波清洗器(山市超聲儀器有限公司).

1.2 試 藥

龍膽苦苷(批號(hào):MUST－12090406)，其購(gòu)自中國(guó)成都曼思特生物科技有限公司;甲醇:色譜純(DikmaPure);甲醇:分析純(天津市天力化學(xué)試劑有限公司);水:娃哈哈純凈水;東北三省龍膽分別采自黑龍江、遼寧、吉林，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心高級(jí)實(shí)驗(yàn)師郭淑艷鑒定為龍膽科(Gentianaceae)龍膽屬(Gentiana)北龍膽(Gentianachinensis)，見(jiàn)表1;東北三省龍膽根莖經(jīng)清洗、陰干、粉碎、烘干、過(guò)四號(hào)篩備用.

表1 東北三省不同產(chǎn)地的龍膽樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

按照中國(guó)藥典2010版一部，精密稱(chēng)取龍膽苦苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含有0.2 mg的溶液，溶解、搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，備用.

2.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)取各產(chǎn)地干燥的龍膽根莖粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入甲醇20 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流15 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，濾液備用，精密量取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得.

2.3 色譜條件

色譜柱 Spherisorb－C18(4.6×250 mm，5 μm)，水(A)－甲醇(B)進(jìn)行梯度洗脫:0～5 min，0～40%B;5～15 min，40% ～60%B;15～25 min，60% ～80%B;25～30 min，80% ～100%B;30～40 min，100% ～ 100%B;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)時(shí)間:40 min.

2.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，進(jìn)行檢測(cè).色譜圖見(jiàn)圖1、2.

圖1 龍膽苦苷色譜圖

圖2 供試品HPLC指紋圖譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取S3號(hào)樣品適量，按照供試品溶液制備方法處理并按照梯度洗脫條件進(jìn)樣測(cè)定，在0、1、2、4、8、12 h 進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要共有峰相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.98%及相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.79%，表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取S9號(hào)樣品適量，按照供試品溶液制備方法處理并按照梯度洗脫條件進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要共有峰相對(duì)峰面積的RSD均小于2.97%及相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均小于2.69%，表明儀器和方法的精密度良好.

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取S12號(hào)樣品適量，6份，按照供試品溶液制備方法處理并按照梯度洗脫條件進(jìn)樣測(cè)定.色譜圖中各主要共有峰的相對(duì)峰面積的RSD值均小于2.92%，相對(duì)保留時(shí)間的 RSD值均小于 2.30%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好.

圖3 12批次龍膽的色譜圖疊加圖

2.6 指紋圖譜的建立

取東北三省不同產(chǎn)地的12批龍膽樣品，按照前面確定的方法進(jìn)行樣品測(cè)定，記錄指紋圖譜，如圖3所示.將所測(cè)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版軟件，以龍膽主要成分龍膽苦苷為內(nèi)參比峰，比對(duì)其色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間定性，得到13個(gè)共有峰，建立起共有模式，結(jié)果見(jiàn)表2、3及圖4.

圖4 共有模式圖

表2 12批次龍膽共有指紋峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 12批次龍膽共有指紋峰相對(duì)峰面積

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)東北三省不同產(chǎn)地龍膽的提取物指紋圖譜的研究，對(duì)所得色譜峰進(jìn)行比較，可以得出以下結(jié)論:

1)不同產(chǎn)地的龍膽苦苷含量基本呈現(xiàn):遼寧省地區(qū)＞吉林省地區(qū)＞黑龍江省地區(qū).分析其原因?yàn)?不同的產(chǎn)地、不同的氣候條件、栽培管理與加工環(huán)節(jié)的差異等因素起到了一定的作用.

2)東北三省不同產(chǎn)地的龍膽指紋圖譜顯示:HPLC圖譜比較接近，沒(méi)有明顯的差別，12批不同產(chǎn)地龍膽藥材的特征峰的專(zhuān)屬性和特征性較好，說(shuō)明東北地區(qū)的龍膽，即北龍膽的化學(xué)成分基本相同.

[1]劉 濤，才 謙，付玉芹，等.中藥龍膽的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志，2004，31(1):85－86.

[2]徐麗萍，劉建生，敏 德，等.金龍膽草的化學(xué)成分研究(Ⅰ)[J].中國(guó)中藥雜志，1998，23(5):37－39，64.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[4]王 寧.秦嶺龍膽化學(xué)成分的定性分析[J].青海大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，22(6):1－2.

[5]孫國(guó)祥，侯志飛，張春玲，等.色譜指紋圖譜定性相似度和定量相似度的比較研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(1):75－80.

[6]張海晶，金 蘭，于金平，等.雞冠花乙醇提取物的HPLC指紋圖譜研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014，30(1):18 －20，24.