岳 磊，張 垚，張楠曦

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150080)

細(xì)胞活動的能量主要來自ATP，而80% 以上的ATP是在線粒體中合成的.線粒體是糖、脂肪和氨基酸最終氧化釋放能量的場所，線粒體為一雙層膜圍成的囊狀結(jié)構(gòu)，外膜與內(nèi)膜間的空腔稱為外室，由內(nèi)膜包圍的腔稱為內(nèi)室或線粒體基質(zhì).線粒體外膜通透性較大，分子質(zhì)量在15 ku以下物質(zhì)可自由通過，因此胞質(zhì)成分與線粒體外室基本相似.線粒體內(nèi)膜通透性小，分子質(zhì)量大于1.5 ku物質(zhì)不易通過，但內(nèi)膜存在一些載體蛋白與通道以便運輸某些物質(zhì).質(zhì)子泵存在于內(nèi)膜，它將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子泵入外室，從而形成橫跨線粒體內(nèi)膜的線粒體跨膜電位(mitochondrial membrane potential，用 Δψm表示)[1－3].跨膜電位內(nèi)室為負(fù)，外室為正.事實上，Δψm的變化可以暗示著線粒體蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞色素C的釋放、ATP合成不足等多種線粒體功能相關(guān)變化，也可以提示由線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、細(xì)胞自噬等細(xì)胞機(jī)體的產(chǎn)生機(jī)理.

流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)是以流式細(xì)胞術(shù)為核心技術(shù)，集光學(xué)、電子學(xué)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)以及激光和計算機(jī)等多門學(xué)科和技術(shù)于一體的先進(jìn)科學(xué)技術(shù)設(shè)備[4].它可以對快速直線流動狀態(tài)中的單列細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量分析或分選，具有檢測速度快、測量參數(shù)多、采集數(shù)據(jù)量大[5]、分析全面、分選純度高、方法靈活等特點，是現(xiàn)代科學(xué)研究中的先進(jìn)儀器之一.本文采用常見的4種檢測線粒體膜電位的熒光染料，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行比較，以判定每種方法的優(yōu)缺點.

1 材料和方法

1.1 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur);紫外交聯(lián)儀(Gene CL－1000);低速臺式離心機(jī)(TDL－40C);臺式微量冷凍離心機(jī)(Beckman X－22R)

1.2 細(xì)胞及主要試劑

人類宮頸癌細(xì)胞Hela由哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院提供;羅丹明123和JC－1試劑盒購自北京碧云天公司;TMRE購自Invitrogen公司;DiOC6(3)熒光染料購自Sigma公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，并加入100 IU/mL青霉素及100 IU/mL鏈霉素，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞.

1.3.2 實驗對照組

對照組為未處理的Hela細(xì)胞組，實驗組Hela細(xì)胞經(jīng)UV照射后，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，各組細(xì)胞終濃度均為5×105個/mL.

1.3.3 羅丹明123檢測法

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細(xì)胞懸液，PBS漂洗2次(1 500 r/min，10 min)，加入0.5 mL羅丹明123染液(5 mg/L)(避光操作)，培養(yǎng)箱中染色30 min，用PBS清洗1次(1 500 r/min，10 min)，過200目尼龍網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm.

1.3.4 DiOC6(3)檢測法

取對照組和實驗組細(xì)胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細(xì)胞懸液，PBS漂洗2次，加入DiOC6至終濃度40 nmol/L，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀分析前PBS緩沖液洗滌細(xì)胞.

1.3.5 TMRE 檢測法

取對照組和實驗組細(xì)胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細(xì)胞懸液，PBS漂洗2次，加入TMRE至終濃度為100 nmol/L，37℃孵育30 min，用PBS清洗1次，流式細(xì)胞儀檢測.

1.3.6 JC －1 檢測法

取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶EDTA消化，用PBS制成細(xì)胞懸液，PBS漂洗2次，終濃度JC－1(1 mmol/L)進(jìn)行染色，37℃平衡30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度(具體步驟參照試劑盒說明書).

2 實驗結(jié)果

圖1～3為單色熒光染料結(jié)果分析的直方圖，圖中橫坐標(biāo)為熒光道數(shù)，表示相對熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù).以對照組為參照圖，在主峰的左側(cè)設(shè)置門M1，門內(nèi)的數(shù)值表示熒光強(qiáng)度下降的細(xì)胞百分?jǐn)?shù).

2.1 羅丹明123熒光染料檢測

羅丹明123是一種可透過細(xì)胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑.正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失.而在線粒體膜完整性被破壞時，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，羅丹明123重新釋放出線粒體，發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光[6].羅丹明123檢測結(jié)果如圖1所示.從圖1中可以看出，處理組(29.83%)與對照組(4.21%)相比，門 M1的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，疊加圖中也清晰的看到處理組的峰左移，結(jié)果表明UV照射后的Hela細(xì)胞羅丹明123熒光強(qiáng)度減弱，Δψm明顯降低.

2.2 DiOC6(3)熒光染料檢測

DiOC6(3)是一類親脂性熒光染料，用于標(biāo)記細(xì)胞膜和疏水性組織.這是一類環(huán)境敏感型熒光染料，當(dāng)它與膜結(jié)合或者與親脂性生物分子(例如蛋白質(zhì)，雖然在水中其熒光強(qiáng)度很弱)結(jié)合時，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng).它們具有很高的淬滅系數(shù)，偏光依賴性和很短的激發(fā)壽命.一旦應(yīng)用于細(xì)胞中，這種染料會在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜中逐步擴(kuò)散，導(dǎo)致在其最佳濃度條件下，將整個細(xì)胞染色.488 nm激發(fā)時最大發(fā)射波長為527 nm，呈綠色熒光[7－8].DiOC6(3)檢測結(jié)果如圖2所示.從圖2中可以看出，處理組(19.07%)與對照組(3.76%)相比，門 M1的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)增多，疊加圖中能看到處理組的峰左移，說明UV照射后的Hela細(xì)胞Δψm降低.

圖1 羅丹明123試劑檢測結(jié)果

圖2 DiOC6(3)試劑檢測結(jié)果

2.3 TMRE熒光染料檢測

TMRE熒光探針為一種帶正電荷、對細(xì)胞通透、無毒的熒光染料，其激發(fā)光波長為543 nm，發(fā)射波長為560 nm.在正常生理條件下，線粒體膜的電壓為內(nèi)負(fù)外正，帶正電的TMRE可迅速進(jìn)入并聚集在線粒體內(nèi).mPTP的開放使線粒體的膜電位消失，導(dǎo)致TMRE從線粒體釋放，因此線粒體內(nèi)TMRE熒光強(qiáng)度變化可以適當(dāng)?shù)胤从尘€粒體膜電位的高低[9－11].TMRE 檢測結(jié)果如圖3所示，該試劑選用FL2通道，處理組(13.65%)與對照組(3.23%)相比，熒光強(qiáng)度減少10.42%，結(jié)果表明UV照射后的Hela細(xì)胞TMRE熒光強(qiáng)度減弱，Δψm降低.

圖3 TMRE試劑檢測結(jié)果

2.4 JC－1熒光染料檢測

JC－1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的陽離子型親脂性熒光探針，能夠自由穿過細(xì)胞膜，隨細(xì)胞膜電位的變化而在膜兩側(cè)保持動態(tài)平衡..可以檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位.在線粒體膜電位較高時，JC－1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波590 nm;在線粒體膜電位較低時，JC－1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC－1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為529 nm.這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化[12].JC－1試劑檢測結(jié)果如圖4所示.由于JC－1在檢測時發(fā)出兩種熒光，因此其結(jié)果分析采用二維散點圖，用“十”字門將圖譜分成四個象限.右上象限(UR)表示JC－1在細(xì)胞內(nèi)以聚合物形式存在，發(fā)出紅色熒光;右下象限(LR)表示JC－1在細(xì)胞內(nèi)以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光.由圖4可以看出，Hela細(xì)胞經(jīng)UV照射后，處理組(16.40%)與對照組(4.46%)相比，綠色熒光明顯增強(qiáng)，表示JC－1單體形態(tài)增多，提示UV處理后的細(xì)胞Δψm降低.

圖4 JC－1試劑檢測結(jié)果

3 討論

研究結(jié)果表明，4種熒光染料均可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體膜電位的檢測.但由于每種染料的檢測原理不同，在染液濃度及孵育時間上也不同，在實際實驗中還要根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇不同的染料.

羅丹明123是流式細(xì)胞儀檢測Δψm的常用熒光染料，它與線粒體結(jié)合能力較高，容易破壞電子傳遞鏈(ETC)，并且釋放緩慢，因此在瞬時熒光染料釋放期間減少對膜電位變化的影響.羅丹明123這一特點，使得它成為實時檢測細(xì)胞急性損傷中線粒體膜電位變化的首選熒光染料.

DiOC6(3)檢測Δψm的方式與羅丹明123比較相似，但與其他熒光染料相比較，DiOC6(3)對線粒體呼吸有較高的毒性，并且由于其實驗用劑量較低，使得該染料對試驗操作的精準(zhǔn)度要求較高.這兩種染料在流式細(xì)胞儀上均用FL1通道檢測[13].

TMRE是一種在非淬滅模式下檢測Δψm的熒光染料，它與線粒體結(jié)合能力較弱，并且釋放迅速，適用于檢測慢性損傷細(xì)胞中線粒體膜電位的變化，或者檢測不同方法處理的各實驗組Δψm差異，在流式細(xì)胞儀中用FL2通道檢測.

與上述單色熒光探針不同，JC－1在檢測線粒體膜電位時是通過聚集體與單體的光譜轉(zhuǎn)換來獲得熒光信號，因此JC－1往往被認(rèn)為是可靠的Δψm指示劑.由于JC－1有較強(qiáng)的光敏感性，并且它的聚集體不能快速的與單體達(dá)到平衡狀態(tài)，因此在使用JC－1染料時要特別注意探針的使用濃度和反應(yīng)時間.JC－1一般更多的用于細(xì)胞凋亡早期線粒體膜電位變化的檢測[14－15].

本實驗采用紫外照射的方式誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，大量實驗研究表明，在細(xì)胞凋亡中，線粒體起著中心調(diào)控作用，而且在凋亡的早期階段，首先發(fā)生的是線粒體膜電位的改變.通過這一特點，我們考察了4種熒光染料對在細(xì)胞凋亡中Δψm變化的指示作用.結(jié)果顯示:羅丹明檢測到的 Δψm變化較大，實驗組與對照組比較相差25.62%，這可能與羅丹明123適用于檢測細(xì)胞急性損傷中線粒體膜電位變化相關(guān).

不僅僅是細(xì)胞凋亡，在其他線粒體調(diào)控機(jī)制中，線粒體膜電位的變化也是重要監(jiān)測指標(biāo)之一.隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀已實現(xiàn)多個激光器獲得多色熒光參數(shù)，同時完成分類、實現(xiàn)實時同步分析的功能，這大大提高了流式細(xì)胞儀的應(yīng)用范圍及精確度，也使其成為檢測線粒體膜電位的重要科學(xué)手段.由于每個染料的檢測原理不同，與線粒體的結(jié)合方式不同，在實際應(yīng)用中要根據(jù)不同的實驗選擇不同的染料，以保證獲得較為準(zhǔn)確的實驗結(jié)果.

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