汪露祥，陳 龍，吳獻(xiàn)忠，謝翠艷，蔣 振，方 威，鐘善傳

(1.黃山市人民醫(yī)院 病理科，安徽 黃山 245000，2.解放軍第532醫(yī)院 病理科，安徽 黃山 245000)

胸水細(xì)胞形態(tài)多樣，有時(shí)腺癌細(xì)胞僅表現(xiàn)出輕度的異型性，而反應(yīng)性間皮細(xì)胞卻可能表現(xiàn)出重度的異型性，在常規(guī)胸水細(xì)胞學(xué)檢查中，反應(yīng)性間皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞的鑒別診斷是胸水細(xì)胞學(xué)診斷的難點(diǎn)。胸水檢查出惡性細(xì)胞，對(duì)患者的臨床處理和預(yù)后判斷都具有重要意義，因此，區(qū)分反應(yīng)性間皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)移性腺癌具有重要臨床價(jià)值。近年來(lái)，許多免疫標(biāo)記物應(yīng)用于胸水細(xì)胞蠟塊的輔助診斷。然而，到目前為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有足夠靈敏度和特異性的標(biāo)志物，多種抗體的聯(lián)合應(yīng)用輔助胸水細(xì)胞學(xué)診斷成為研究熱點(diǎn)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUTs)是介導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，其中GLUT1是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。近年來(lái)，不斷有報(bào)道認(rèn)為GLUT1表達(dá)于許多惡性腫瘤，而在反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞中不表達(dá)。Claudin-4是一個(gè)緊密連接相關(guān)蛋白，在上皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，而在間皮細(xì)胞中表達(dá)缺失。最近的研究表明，Claudin-4在鑒別肺腺癌細(xì)胞和間皮瘤細(xì)胞中具有重要意義。本研究在細(xì)胞蠟塊的基礎(chǔ)上，行免疫組化聯(lián)合檢測(cè)GLUT1和Claudin-4，鑒別反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞和轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞，彌補(bǔ)單純細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的局限性，為臨床診斷、治療及判斷預(yù)后提供更為可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集安徽省黃山市人民醫(yī)院病理科2011年12月～2014年12月胸水病例共55例，其中轉(zhuǎn)移性肺腺癌30例，男性16例，女性14例，年齡45～77歲(中位年齡57歲);反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞胸水患者25例，男性13例，女性12例，年齡52～73歲(中位年齡58歲)。所有病例均經(jīng)活檢或組織病理檢查明確診斷。

1.2 細(xì)胞切片的制備 收集新鮮胸水標(biāo)本200 mL左右，室溫下3000 r/min離心10 min。取沉渣表層細(xì)胞，經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋制成細(xì)胞塊。切片3張，1張用于HE染色，常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查;另2張分別用于GLUT1和Claudin-4免疫組化染色。

1.3 免疫組化染色 免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶(streptavidin-peroxidase，SP)法。石蠟切片厚2～3 μm，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，胸水紅細(xì)胞作為GLUT1內(nèi)源性陽(yáng)性對(duì)照，已知Claudin-4陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。GLUT1抗體購(gòu)自福州邁新生物有限公司，Claudin-4抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.4 結(jié)果判定方法 GLUT1和Claudin-4陽(yáng)性顆粒均呈棕黃色，陽(yáng)性表達(dá)主要定位于胞膜，胞質(zhì)偶有弱表達(dá)，兩者均在細(xì)胞連接處更為明顯。無(wú)色、染色淺與背景幾乎一致及高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞占同類(lèi)細(xì)胞的5%以下為陰性;陽(yáng)性染色占6% ～25%為(+)，26% ～50% 為()，51% ～75% 為)，75%以上為()。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。GLUT1和Claudin-4聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異性采用平行試驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 胸水細(xì)胞塊GLUT1免疫組化染色結(jié)果 肺腺癌細(xì)胞GLUT1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色顆粒外觀，主要定位于胞膜，紅細(xì)胞也呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1)。30例肺腺癌細(xì)胞中有28例癌細(xì)胞GLUT1呈陽(yáng)性表達(dá)，占93.3%。25例反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞胸水患者中只有1例呈弱陽(yáng)性表達(dá)(+)，占4%，且為胞膜淡淺著色。轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的GLUT1陽(yáng)性率具有顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表1。

圖1 GLUT1在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 胸水細(xì)胞塊Claudin-4免疫組化染色結(jié)果Claudin-4在29例(29/30)肺腺癌細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，大部分呈膜彌漫強(qiáng)陽(yáng)性(圖2)，少部分呈膜中等強(qiáng)度染色。25例反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞中僅1例呈弱陽(yáng)性(+)，占4%，其余24例均為陰性。轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的Claudin-4陽(yáng)性率具有顯著性差異(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

圖2 Claudin-4在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

表1 胸水細(xì)胞GLUT1免疫組化染色結(jié)果

表2 胸水細(xì)胞Claudin-4免疫組化染色結(jié)果

2.3 GLUT1和Claudin-4聯(lián)合檢測(cè)在胸水中的診斷價(jià)值 從GLUT1和Claudin-4在胸水細(xì)胞的免疫組化結(jié)果來(lái)看，大部分肺腺癌細(xì)胞GLUT1和Claudin-4均呈陽(yáng)性，而反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞GLUT1和Claudin-4呈陰性。通過(guò)計(jì)算兩者聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果，二者平行法檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)移性肺腺癌診斷的靈敏度為100%，特異性為92.0%。見(jiàn)表3。

表3 聯(lián)合檢測(cè)GLUT1和Claudin-4對(duì)肺腺癌診斷的靈敏度和特異性

3 討論

在胸水細(xì)胞學(xué)診斷中，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片具有簡(jiǎn)捷方便、快速經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，但是由于涂片方法本身的局限性容易造成細(xì)胞厚薄不均、結(jié)構(gòu)不清，甚至出現(xiàn)人工假象，給診斷帶來(lái)干擾。近年來(lái)，液基細(xì)胞技術(shù)在胸水中的應(yīng)用大大提高了細(xì)胞制片的質(zhì)量。然而，轉(zhuǎn)移性腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞有時(shí)在形態(tài)上十分相似，僅靠細(xì)胞學(xué)形態(tài)往往不足以診斷，需要進(jìn)一步檢查才能明確診斷。當(dāng)胸水內(nèi)的癌細(xì)胞僅表現(xiàn)為輕度的異型性時(shí)，常與反應(yīng)性間皮細(xì)胞相混淆，導(dǎo)致臨床高度懷疑惡性的胸水標(biāo)本，反復(fù)的細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果卻未見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)，以細(xì)胞蠟塊為基礎(chǔ)的免疫組化染色不斷應(yīng)用于細(xì)胞學(xué)診斷。本研究利用細(xì)胞蠟塊技術(shù)，通過(guò)免疫組化方法聯(lián)合檢測(cè)GLUT1和Claudin-4，評(píng)估它們對(duì)胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌與反應(yīng)性增生上皮細(xì)胞的鑒別診斷價(jià)值。

GLUT1是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，絕大多數(shù)組織細(xì)胞不能獨(dú)立運(yùn)輸葡萄糖，需借助細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過(guò)易化擴(kuò)散方式順濃度梯度運(yùn)輸葡萄糖［1－3］。研究表明，GLUT1僅在少量正常組織中表達(dá)，包括在紅細(xì)胞、睪丸生精細(xì)胞、腎小管、周?chē)窠?jīng)束膜、血腦屏障的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及胎盤(pán)的滋養(yǎng)層和血管，在反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞中不表達(dá)［4］。腫瘤細(xì)胞的主要特點(diǎn)是持續(xù)快速的增殖，這種增長(zhǎng)方式必然導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取增加以滿(mǎn)足自身代謝需要。研究表明，GLUT1在上皮源性惡性腫瘤中廣泛表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌以及一些頭頸部腫瘤，另外，GLUT1 在惡性間皮瘤中也呈陽(yáng)性表達(dá)［1，5］。這些都提示GLUT1可能作為惡性腫瘤的分子標(biāo)志物。因此，在胸水細(xì)胞中GLUT1表達(dá)陽(yáng)性提示上皮性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移或惡性間皮瘤。本研究表明，GLUT1在胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌的靈敏度為93.3%，特異性為96.0%，可作為鑒別轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的分子標(biāo)志物。

Claudins是細(xì)胞間緊密連接骨架蛋白，有維持細(xì)胞極向排列的功能，而上皮性腫瘤的一個(gè)重要形態(tài)學(xué)特征就是瘤細(xì)胞的排列極向消失，因此，Claudins與上皮性腫瘤關(guān)系密切。另外，緊密連接完整性喪失造成癌細(xì)胞的凝聚力降低及侵襲性增加，也是腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中重要的一步［6］。Claudin-4是Claudins家族的主要成員之一，主要分布在肺、腎、小腸、結(jié)腸和腦組織中。近年的研究表明，Claudin-4在原發(fā)性卵巢癌、結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌、膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌及前列腺癌等一系列惡性腫瘤中表達(dá)顯著增高，而在胸腹水反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞中不表達(dá)，提示Claudin-4可用于鑒別腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞［7］。我們的研究表明，Claudin-4在胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞的靈敏度為96.6%，特異性為96.0%，是鑒別胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的一個(gè)很好的指標(biāo)。

在目前的臨床病理診斷工作中，CK7(Cytokeratin 7，細(xì)胞角蛋白7)和 TTF-1(Thyroid transcription factor-1，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1)作為常規(guī)肺腺癌標(biāo)記物，而CR(Calrentinin，鈣結(jié)合蛋白)和MC(Mesothelial cell，間皮細(xì)胞蛋白)作為間皮細(xì)胞標(biāo)記物。有研究者對(duì)它們?cè)阼b別胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性間皮細(xì)胞的意義進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CK7與TTF-1聯(lián)合標(biāo)記對(duì)肺腺癌細(xì)胞的靈敏度為88%，特異性為100%;CR與MC聯(lián)合標(biāo)記對(duì)反應(yīng)性間皮細(xì)胞的靈敏度為60%，特異性為95%［8］。我們通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)胸水GLUT1和Claudin-4在肺腺癌細(xì)胞與反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)具有兩個(gè)重要意義。首先，GLUT1和Claudin-4均表現(xiàn)為高度的靈敏度和特異性，二者聯(lián)合標(biāo)記對(duì)胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞的靈敏度和特異性分別為100%和92.0%，優(yōu)于常規(guī)CK7、TTF-1、CR和 MC四種抗體的聯(lián)合檢測(cè)，為臨床病理診斷提供了更好的選擇。其次，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，GLUT1 表達(dá)于惡性間皮瘤［1，5］，而 Claudin-4不表達(dá)［9］。因此，GLUT1和 Claudin-4聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)于胸水轉(zhuǎn)移性肺腺癌細(xì)胞、惡性間皮瘤細(xì)胞和反應(yīng)性增生間皮細(xì)胞的診斷和鑒別診斷都具有重要意義，有待更深入的研究。本研究為下一步的研究工作提供了重要的基礎(chǔ)資料。

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