韋 正洪海梅潘立衛(wèi)蔣利榮

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用重點實驗室，廣西 宜州 546300；3.桂西北特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點實驗室，廣西 宜州 546300）

正交實驗優(yōu)選紅藍草多糖提取工藝研究

韋 正1，2，3洪海梅1，2，3潘立衛(wèi)1，2，3蔣利榮1，2，3

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 宜州 546300；2.微生物及植物資源開發(fā)利用重點實驗室，廣西 宜州 546300；3.桂西北特色資源研究與開發(fā)廣西高校重點實驗室，廣西 宜州 546300）

采用硫酸-苯酚法測定紅藍草多糖的含量，用正交設(shè)計法篩選和優(yōu)化紅藍草多糖的提取工藝。以料液比、提取時間、溶液的pH值、提取溫度作為因素，進行L9(34)正交試驗。各因素對提取紅藍草水溶性多糖的影響為：提取溫度＞料液比＞提取溶劑pH值＞提取時間。確定較優(yōu)提取工藝為料液比為1:40（m:v），提取溫度100℃，提取時間為2h，提取溶劑pH值4.5，在該工藝條件下，紅藍草多糖的得率為8.018%，說明紅藍草除了主成分紫藍素類、黃酮類外，其多糖的含量也較高。

紅藍草；多糖；提取工藝

紅藍草Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.，為爵床科紅絲線草屬植物[1]，又名紅絲線，其汁液為天然染料之一[2]。紅藍草具有清肺止咳，涼血止血，散瘀止痛等作用，其主要含有多糖、生物堿、黃酮類、三萜、甾體及其苷類、苯丙素類、揮發(fā)油、醌類化合物、醇、有機酸等化學(xué)成分[3-10]。在研究的藍草多糖提取工藝文獻報道較少，大都報道研究其總黃酮及色素的提取工藝，故本文擬以正交設(shè)計法優(yōu)選出合理較佳的多糖提取工藝條件，旨為紅藍草的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent Cary 8454 UV-Vis二極管陣列分光光度計(美國Agilent公司)；電子分析天平AE240S (十萬分之一)， BP121S(萬分之一)( 梅特勒-托利多儀器有限公司)；SSY-4型電子恒溫水浴鍋 (北京泰克儀器有限公)；pH計pHS-3B型(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SB25-12D 型超聲波清洗器 ( 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵SHB-III型(鄭州長城科工貿(mào)易有限公司)。

1.2 材料

苯酚、95%乙醇、甲醇、濃硫酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，所用水為去離子水，其他試劑均為分析純。葡萄糖對照品對照品(均購于成都曼斯特生物制品公司，純度均＞98%，批號為A00308-20)。紅藍草藥材采購于宜州市十字街藥材市場，經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院植物學(xué)覃國樂副教授鑒定為爵床科紅絲線草屬植物Peristrophe roxburghiana(Schult.)Brem紅藍草。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅藍草的預(yù)處理

將烘干的紅藍草粉碎后過80目篩，備用。取一部分用95%乙醇浸提2h進行脫脂，抽濾，在60℃恒溫烘干24h后，放于干燥器中備用

2.2 紅藍草多糖的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

取葡萄糖對照品適量，精密稱定，置棕色容量瓶中，加水制成每1mL含0.100mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取藥材粉適量1.0g，精密稱定，置250ml圓底燒瓶中，加水20ml，100℃下回流提取90min，趁熱過濾，溶液定容至250ml，即得。

2.2.3 最大吸收波長的確定

將葡萄糖對照品與供試品經(jīng)苯酚-濃硫酸處理后，于400～600nm波長下掃描，結(jié)果對照品與供試品均在490nm處有最大吸收，故選取490nm為測定波長。

2.2.4 標準曲線的繪制

分別精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，置于具塞試管中，加水補足至2ml，搖勻，加5%苯酚溶液1ml，搖勻，再迅速加入濃硫酸5ml，搖勻，放置10min，于90℃水浴保溫15min，取出，冷水迅速冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在490nm波長處測定吸光度，吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程y=52.484x-0.0306，R=0.9991，結(jié)果表明葡萄糖在線性范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

多糖含量（%）=(A-0.0306)/52.484*8/0.3*250/1000/ m*100%，

式中：A為供試品溶液的吸光度值（ABS）、m為供試品藥材取樣量（g）。

2.2.5 精密度試驗

精密量取對照品溶液1.0mL，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2mL”起，依次顯色、測吸光度值，重復(fù)測定吸光度值6次，計算吸光度值的RSD為0.67%，表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取藥材粗粉約1.0g，精密稱定，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2mL”起，依次顯色、測吸光度值，在0、0.5、1、2、6、12h分別測定吸光度值，測得多糖含量的RSD為1.32%。實驗表明樣品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3 單因素考察

2.3.1 料液比考察

取藥材粉約1.0g，精密稱定6份，置圓底燒瓶中，加入不等量蒸餾水1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1：40；100℃下回流提取2h，趁熱過濾，定容至250ml，取2ml定容至25ml，得樣品溶液，取0.4ml樣品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2ml”起，依次顯色、測吸光度值。由圖1 可知，料液比為30倍之后，紅藍草多糖提取率趨于平緩，選擇適宜料液比為1:30。

圖1 料液比考察結(jié)果

2.3.2 提取時間考察

取藥材粗粉約1.0g，精密稱定6份，置燒瓶中，加入20mL蒸餾水，100℃條件下回流提取不同時間后，趁熱過濾，濾液定容至250ml容量瓶，取2mL定容至25mL，得樣品溶液，取0.3mL樣品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2mL”起，依次顯色、測吸光度值。從圖2可以看出，提取時間對紅藍草多糖提取率影響較弱，隨著浸提時間的延長，多糖提取率呈平緩的趨勢，選擇適宜的提取時間為2h。

圖2 提取時間考察結(jié)果

2.3.3 提取溫度考察

從圖3可以看出，隨著浸提溫度的升高，多糖提取率逐漸增大，當溫度上升為100 ℃時，多糖提取率達到最高。因此，最佳提取溫度為100℃，紅藍草多糖的提取率最佳。

圖3 提取溫度考察結(jié)果

2.3.4 提取溶劑pH值考察

不同溫度條件下回流提取，結(jié)果得出在提取溶劑pH值為4.5條件下，紅藍草多糖的提取率最佳，如圖4所示。

圖4 提取溶劑pH值考察結(jié)果

2.3.5 提取次數(shù)對多糖提取率的影響

由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，多糖的提取率呈平滑上升趨勢，但提取次數(shù)超過1次后多糖提取率增加緩慢，因此， 選擇最適提取次數(shù)為1次。

圖5 提取次數(shù)考察結(jié)果

2.4 正交實驗

通過前期的單因素實驗結(jié)果，確定了料液比、回流提取時間、提取溶劑的pH值、提取次數(shù)、提取的溫度，結(jié)果顯示提取次數(shù)對多糖提取率無顯著影響，故確定提取次數(shù)為1次。浸提工藝以料液比、回流提取時間、提取溶劑的pH值、浸提溫度為因變量，設(shè)計法設(shè)計四因素三水平實驗。實驗方案設(shè)計和結(jié)果見表1、表2。

表1 正交設(shè)計因素與水平

表2 正交設(shè)計因素與水平

表3 方差分析

由表2、3可知，提取溫度對紅藍草多糖的提取結(jié)果影響最大，料液比次之，提取時間影響較??；其最佳的提取條件為A3B2C2D3，即料液比為1:40（m:V），提取溫度100℃，提取時間為120min，提取溶劑pH值4.5，提取次數(shù)1次。

2.5 驗證實驗

在最佳工藝條件下，取藥材粗粉約1.0g，試精密稱定6份，進行6次重復(fù)性實驗，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2mL”起，依次顯色，分別測定其吸光度值，其含量分別為8.2349%、8.1384%、8.2543%、8.1724%、7.9103%、8.3634%，平均提取率為8.018%，多糖含量的RSD為1.87%。說明該工藝穩(wěn)定

2.6 加樣回收率實驗

準確吸取取已知多糖含量（以驗證試驗平均值計算）的藥材粗粉6份，每份約0.05g，精密稱定，精密加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項下的方法制備供試品溶液，取0.3mL供試品溶液，照“2.2.4”的方法，自“加水補足至2mL”起，依次顯色，分別測定其吸光度值，計算多糖含量。由表4可知，回收率為94.78%，說明紅藍草多糖測定方法可行。

表4 紅藍草多糖加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

3 討論

本文以多糖提取率為考察指標，采用正交實驗優(yōu)化了紅藍草多糖熱水浸提工藝。最終確定紅藍草多糖的最佳提取工藝為：料液比為1:40（m:V），提取溫度100℃，提取時間為120min，提取溶劑pH值4.5。分析實驗結(jié)果得出料液比、提取時間、提取溫度、提取溶劑pH值4.5對多糖提取率有不同程度的影響，其中提取溫度、料液比影響最顯著，各因素間存在不同程度的交互作用。該方法比較直觀、方便，實驗精度高，同時也說明紅藍草除了主成分紫藍素類、黃酮類外，其多糖的含量也較高，為紅藍草的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草:第7卷[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1999:466-467.

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[3] 謝運昌,蔣小華,文永新,等.紫藍素化合物、其制備方法及其用途[P].CN:03117188.5,2005.

[4] 馬河.紫藍素純化工藝及質(zhì)量控制研究[D].湖南長沙:湖南中醫(yī)藥大學(xué),2006.

[5] 徐玉琳,林穎,周誠,等.UV法測定狗肝菜與紅絲線草的多糖含量[J]中藥新藥與臨床藥理,2008,19(5): 387-389.乏一定的理論知識，并且教師的專業(yè)水平也較低，那么其培養(yǎng)出來的學(xué)生往往是專業(yè)水平較低的學(xué)生。由此可見，教師的專業(yè)水平、理論水平是非常重要的。

當前，“雙師型”教師是學(xué)校較為缺乏一種類型，因此學(xué)校要重視對教師的培養(yǎng)。在技能比賽中，筆者會發(fā)現(xiàn)：有的教師自身的實踐操作水平較高，但是其自身的理論水平較低；有的教師自身的實踐操作水平、理論水平卻都比較低。所以學(xué)校要重視教師的培訓(xùn)，在培訓(xùn)中來提升教師的專業(yè)水平。

學(xué)校在培養(yǎng)“雙師型”教師隊伍的時候要采取以下的措施：第一，安排老師到企業(yè)鍛煉，不斷提高老師的專業(yè)水平。第二，學(xué)校要安排專門的時間讓教師參加專業(yè)培訓(xùn)班，在培訓(xùn)之后要考核老師，只有考核通過的教師才可以繼續(xù)任職。第三，從企業(yè)聘請有經(jīng)驗的員工來擔任該專業(yè)的老師，從而可以將一些實際操作中遇到的問題告訴學(xué)生。第四，構(gòu)建科學(xué)的獎懲機制，及時表揚在工作中表現(xiàn)突出的教師。

（4）借助技能大賽來提高畢業(yè)生的就業(yè)競爭力

技能大賽的目的在于引導(dǎo)學(xué)校重視技能訓(xùn)練，促使學(xué)生的技能水平得以提高。在大賽中，學(xué)生可以將自身的才能展現(xiàn)出來，并且企業(yè)也可以了解到學(xué)生，從而便于企業(yè)選拔人才。在比賽時，學(xué)校要邀請企業(yè)來當評委，并且要召開現(xiàn)場招聘會，這樣做既為學(xué)生提供了就業(yè)機會，又便于企業(yè)從中選取更多優(yōu)秀的人才。在平時的課程設(shè)置中，學(xué)校要充分考慮到企業(yè)的實際需求，從而提高畢業(yè)生的就業(yè)競爭力。

3 結(jié)束語

建筑工程類技能大賽不僅推動著學(xué)校課程體系的改革，還推動著學(xué)校教學(xué)方式的改革。與此同時技能大賽這一模式具有明顯的操作性，因此在參賽過程中學(xué)生的實踐操作能力得到了明顯的提高。

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Optimize Extraction Process of Polysaccharide in Peristrophe roxburghiana(Schult.)Bremk.

To optimize the extraction process of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. Sulfuric acid - phenol method is used to determine the content of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana. The influence of solid- liquid ratio、temperature、 time and extraction solution pH on extraction yield of the polysaccharide in Peristrophe roxburghiana were discussed with orthogonal test method. The impact sequence of the factors on the extraction rate of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana was as follows: temperature＞solid-liquid ratio＞extraction solution pH＞time; The optimal extraction condition was extraction temperature of 100℃、solid- liquid ratio of 1:40、extraction time of 2h and extracted solution pH=4.5. Under these optimal conditions,the extracting rates of polysaccharide in Peristrophe roxburghiana is 8.018%.The content of polysaccharide is high which can be exploited and utilized as another new ingredient.

Peristrophe roxburghiana ; polysaccharides; extraction process

R284.2

A

1008-1151(2015)03-0068-03

2015-02-11

廣西教育廳高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(KY2015YB265);校級課題(2014QN-N001)。

韋正（1986－），男，河池學(xué)院助教，從事民族藥品質(zhì)與藥效相關(guān)性研究、藥物分析、中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標準化研究。