蔣瑞彬，黃晶晶，李浩宇，潘 平，蔣福升，錢朝東，丁志山

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

肺癌是我國最常見的癌癥之一，其中非小細(xì)胞肺癌占原發(fā)癌的75%～80%[1]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，在正常組織及腫瘤組織都廣泛存在，它對(duì)維持機(jī)體的穩(wěn)定起到非常重要的作用[2]。近年來，隨著的對(duì)凋亡機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)凋亡與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展中存在密切的關(guān)系，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡成為目前研究腫瘤的靶點(diǎn)之一，也成為評(píng)價(jià)腫瘤治療效果的指標(biāo)之一。白及學(xué)名Bletilla striata（Thunb.）Reichb.F.，為蘭科多年生草本球根植物，以干燥的塊莖入藥，用于治療咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂等癥[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，白及含有的薜藶果糖可抑制腫瘤細(xì)胞的增長[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，白及黏液質(zhì)對(duì)大鼠瓦克癌（W256）、小鼠子宮癌（U14）、小鼠艾氏腹水癌、肝癌和肉瘤180 均有抑制作用。這可為白及用于臨床治療腫瘤疾病提供新的理論依據(jù)[5]。但全世界對(duì)于白及的研究還是很少，特別是抗腫瘤相關(guān)的研究，其活性成分和相關(guān)的藥理作用還有待于我們繼續(xù)研究[6-7]。

隨著中國對(duì)于中醫(yī)藥事業(yè)的重視，白及在臨床的需求越來越多，用藥量不斷增加[8]。白及的野生資源越來越少，已被列為國家瀕危珍稀保護(hù)植物名錄[9]。白及的藥用部位為塊莖，而在實(shí)際的操作過程中，白及的須根被大量浪費(fèi)，在土地干旱的地區(qū)，白及的須根與塊莖的比例達(dá)到1∶3～1∶4[10]。研究發(fā)現(xiàn)，人參總皂苷在主根的含量為5.22%，但須根卻達(dá)到11.52%[11-12]，而人參總皂苷是人參的有效成分之一。單從人參皂苷含量看，須根的藥用價(jià)值比人參主根高。因此，本研究將觀察白及塊莖和白及須根醇提物對(duì)肺腺癌細(xì)胞A549 增殖凋亡及相關(guān)機(jī)制的影響，并比較它們對(duì)A549 細(xì)胞抑制增殖的作用能力，以探討白及醇提物在誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料

1.1 藥材

白及購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)飲片廠，白及塊莖及白及須根醇提物由本實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 試劑

RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國GIBCOBRL 公司，批號(hào)：13112105）、胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：130407）；Hoechst 33342 染料（Sigma P4170）、PI 染料（Sigma P2261）；青霉素鈉鹽（華北制藥有限公司，批號(hào)：1104303）；鏈霉素（華北制藥有限公司，批號(hào)：1107106）；胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司，Amresco 分裝）；二甲基亞砜（DMSO）（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20120323）。

1.3 儀器

萬分之一精密電子天平（AR2130 Ohaus Corp.Pine Brook，NJ，USA）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation HEPA CLASS100）；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71）；酶標(biāo)儀（Labsystems Wellscan Mk3）；流式細(xì)胞儀（GAVUA INSYTE 5）；熒光定量PCR 儀（StepOnePlusTM，USA）。

1.4 細(xì)胞株

肺腺癌細(xì)胞A549 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生物技術(shù)研究所提供。

2 方法

2.1 增殖抑制實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞A549 制成3×104mL-1細(xì)胞懸液，按每孔100μL 接種于96 孔板，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中孵 育 24h， 吸 掉 原 培 養(yǎng) 液， 用 不 同 濃 度（10，20，30，40，50，60μg·mL-1），每孔100μL 的白及塊莖醇提物和須根醇提物分別處理24、48h 后，結(jié)束前4h 加入1.9mg·mL-1的MTS 液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，于酶標(biāo)儀490nm 波長處測定吸光度（A）值，重復(fù)3 次。細(xì)胞抑制率=（1-A加藥/A對(duì)照）×100%，取3個(gè)重復(fù)孔為平均值，計(jì)算白及塊莖醇提物與須根醇提物作用24、48h 的細(xì)胞成活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.2 Hoechst-PI 雙染白及塊莖醇提物與須根醇提物誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549 凋亡的影響

將細(xì)胞以3×103/孔接入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待其生長24h 貼壁后， 更換含有濃度為30，40，50μg·mL-1；白及塊莖醇提物與須根醇提物的RPMI 1640 培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，PBS 洗2 遍，分別加入Hoechst 與PI 溶液常溫避光孵育10min，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

2.3 FITC 標(biāo)記的Annexin-V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)分析

取經(jīng)藥物處理的A549 細(xì)胞用不含EDTA 的胰酶消化收集，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次（2 000r/min 離心5min） 收集2×105細(xì)胞，加入500μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻，之后室溫避光反應(yīng)10min，立即用流式細(xì)胞儀檢測Annexin VFITC 陽性（早期凋亡）和Annexin V-FITC/PI 雙染陽性（晚期凋亡）細(xì)胞百分率。

2.4 二維水平細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

將A549 制成2×104mL-1細(xì)胞懸浮液，按苗孔1mL 接到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，待細(xì)胞在培養(yǎng)板上形成均勻的一層，用10μL 的移液器吸頭在培養(yǎng)板的中軸線輕輕劃上一橫，用PBS 洗去細(xì)胞殘骸。分別加入含有濃度為30，40，50μg·mL-1白及塊莖醇提物與須根醇提物的培養(yǎng)液培養(yǎng)，在0，12，24，48h 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況，利用目鏡的刻度尺測靈劃痕的寬度（S），每個(gè)孔分別測量5 個(gè)點(diǎn)（兩端，中間，左1/4，右1/4），最后平均值。細(xì)胞遷移率的計(jì)算公式如下：

細(xì)胞遷移率=（S零時(shí)間點(diǎn)-S測量點(diǎn)）/S零時(shí)間點(diǎn)×100%

2.5 RT-PCR 法檢測Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因的mRNA 表達(dá)量

細(xì)胞分別經(jīng)過30，40，50μg·mL-1白及須根醇提物處理48h 后用胰酶消化離心后，采用Trizol 法提取細(xì)胞的總RNA，后采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量PCR 擴(kuò)增Bcl-2、Bax、ICAM-1，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，引物參考文獻(xiàn)[13]中的序列，引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。Bcl-2 引物序列：上游引物為5’-TgTgTgTggAgAgCgTCAACC-3’，下游引物為5’-TTCAgAgACAgCCAggAgAAATC-3’；Bax 引物序列：上游引物為5’-TCAggATgCgTCCACCAAgAA-3’，下游引物為5’-TCCCggAggAAgTCCAATgTC-3’；ICAM-1引物序列：上游引物為5’-TAgCCAACCAATgTgCTATT-3’，下 游 引 物 為5’-CAgCgTAgggTAAggTTCTTg-3’；內(nèi)參（GAPDH）序列為：上游引物為5’-ATT CAACggCACAgTCAAgg-3’，下游引物為5’-gCAgAAggggCggAgATgA-3’。在熒光定量PCR 儀中設(shè)置一下參數(shù)：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性20 sec，55℃退火20 sec，72℃延伸20 sec，讀板，共40 個(gè)循環(huán)；融解曲線。得到每個(gè)樣品的Ct 值，以空白對(duì)照組為對(duì)照，以GAPDH 為內(nèi)參基因，計(jì)算每個(gè)樣品的目的基因的相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct。

△△Ct =[待測組目的基因平均Ct 值-待測組內(nèi)參基因平均Ct 值]-[對(duì)照組目的基因平均Ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct 值]。

2.6 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析來比較各組間的差別有無顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 白及須根醇提物及塊莖醇提物對(duì)A549 細(xì)胞增殖的影響

3 結(jié)果

3.1 白及塊莖醇提物及須根醇提物對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549 的增值影響。

隨著藥物濃度的提高，白及塊莖醇提物與須根醇提物都能明顯降低細(xì)胞的存活率，有明顯的劑量依賴關(guān)系。由圖1 可以看出，在相同的作用時(shí)間和藥物濃度的情況下，白及須根醇提物抑制A549 細(xì)胞的增值效果明顯好于白及塊莖醇提物。

圖2 Hoechst-PI 雙染白及須根醇提物誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549 凋亡的影響

3.2 Hoechst-PI 雙染白及須根醇提物誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞A549 凋亡的影響

通過Hoechst-PI 雙染結(jié)果可知，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。對(duì)照組細(xì)胞呈梭形或橢圓形，胞漿飽滿，核區(qū)染色均勻，給藥組隨著濃度升高，凋亡細(xì)胞明顯增多。在藥濃度為40μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞皺縮，核區(qū)體積變小，Hoechst 染色可見致密濃染熒光。在藥濃度為50μg·mL-1時(shí)，細(xì)胞開始大量死亡，PI 染色后可見強(qiáng)紅色熒光，見圖2。

3.3 FITC 標(biāo)記的Annexin-V/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)

由圖3 可知，白及須根醇提物誘導(dǎo)A549 細(xì)胞株Annexin-FITC 陽性（早期凋亡）和Annexin VFITC/PI 雙染陽性（晚期凋亡）細(xì)胞百分率增高，呈現(xiàn)出濃度依賴性。

3.4 白及須根醇提物對(duì)A549 遷移的影響

由圖4 可知，與對(duì)照組相比，當(dāng)細(xì)胞給予30，40，50μg·mL-1的白及須根醇提物時(shí)，48h 時(shí)A549 細(xì) 胞 的 遷 移 率 分 別 為65.1% 、50.93% 、24.17%，說明在48h 內(nèi)白及須根醇提物可以明顯的抑制住A549 在二維水平上的移動(dòng)。

3.5 白及須根醇提物對(duì)肺腺癌A549 細(xì)胞Bcl-2、Bax、ICAM-1 基因mRNA 的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白及須根醇提物能夠有效的降低ICAM-1 及bcl-2 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量，并且隨著藥物濃度的增加而降低，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因bax 隨著藥物濃度的增加其表達(dá)量增加，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。這就說明白及須根醇提物能夠通過抑制bcl-2 基因的表達(dá)，降低Bcl-2 與Bax的比率來誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡，也能通過抑制ICAM-1 基因的表達(dá)來抑制A549 肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和粘附見圖5。

圖3 Annexin-V/PI 雙染細(xì)胞流式儀分析

圖4 不同濃度白及須根醇提物對(duì)A549 細(xì)胞二維水平遷移的影響

4 討論

白及作為我國的傳統(tǒng)中藥材，是治療肺胃出血的要藥，說明白及的作用靶點(diǎn)主要為肺與胃。本研究利用肺腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)白及的須根醇提物對(duì)于抑制A549 細(xì)胞增殖的效果明顯好于白及的塊莖醇提物，本研究還發(fā)現(xiàn)白及須根醇提物能減少Bcl-2 基因的表達(dá)，降低Bcl-2 與Bax 的比率來誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)通過減少ICAM-1 基因的表達(dá)來抑制腫瘤細(xì)胞的遷移。而在實(shí)際操作過程中，白及的須根作為邊角料而被大量的丟棄，根據(jù)我們的研究結(jié)果，這為以后白及的綜合利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

圖5 不同濃度白及須根醇提物A549 細(xì)胞中ICAM-1、bcl-2、bax 表達(dá)的影響

細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的一個(gè)重要癥狀是細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受損而不能將Hoechst 33342 染料排出細(xì)胞外，因此Hoechst 33342 能夠進(jìn)入到凋亡細(xì)胞要比正常細(xì)胞要多，使熒光增強(qiáng)，而PI 染料不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。通過Hoechst 與PI 的雙染我們就很清楚的區(qū)分開正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞。細(xì)胞的凋亡還受到很多基因的控制，Bcl-2 基因是研究最早于凋亡相關(guān)的基因，也是目前研究最熱的關(guān)于調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因，Bcl-2 主要是通過形成同源二聚體或異源二聚體來調(diào)控細(xì)胞的凋亡，當(dāng)Bax 形成同源二聚體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bax 就能與Bcl-2 形成異源二聚體來實(shí)現(xiàn)Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的功能[14]。在線粒體上的Bcl-2 至少在以下兩個(gè)水平來調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡：①通過改變線粒體膜上的電位來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。因?yàn)樵诩?xì)胞的凋亡過程中，線粒體的疏基會(huì)成為包內(nèi)氧化還原電位的傳感器，Bcl-2 就可以抑制谷胱甘肽的外泄來降低胞內(nèi)的氧化還原電位，從而抑制細(xì)胞的凋亡。②Bcl-2 能夠調(diào)節(jié)線粒體膜上對(duì)某些蛋白前體的通透性，Bax 能在較廣泛的pH 范圍內(nèi)形成離子孔道，它能允許小分子或者是離子穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞的凋亡，而Bcl 的作用相反，它能關(guān)閉Bax 形成的通道，抑制細(xì)胞的凋亡，通過Bcl-2與Bax 的比率來調(diào)控細(xì)胞凋亡[15]。而ICAM-1 是一種細(xì)胞黏附因子，它在人體的正常細(xì)胞內(nèi)一般很少表達(dá)或不表達(dá)，但在一些腫瘤細(xì)胞中ICAM-1 會(huì)過表達(dá)，所以它在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和黏附過程中起到很重要的作用[16]。

綜上所述，白及塊莖及其須根的醇提物都能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞A549 的凋亡，且須根的效果要好于塊莖，所以白及須根具有一定的開發(fā)利用價(jià)值，值得進(jìn)一步研究。

[1] 張敏，白春學(xué)，張新，等. 肺腺癌SPC-A-1 細(xì)胞表皮生長因子受體表達(dá)水平對(duì)其增殖的影響[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28（5）：337-341.

[2] Roberts JR，Allison DC，Donehower RC，et al. Development of polyploidization in taxol-resistant human leukemia cells in vitro[J]. Cancer Res，1990，50：710-716.

[3] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：95.

[4] 方文賢，宋崇順，周立素. 醫(yī)用中藥藥理學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：985-986.

[5] 邸大琳，陳雷，李法慶. 白芨對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞增殖和白細(xì)胞介素-2 產(chǎn)生的影響[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17（12）：2457-2458.

[6] 宋璟璐，王龍，韓鳳娟. 白芨作為抗腫瘤藥物的回顧性分析[J]. 中醫(yī)藥信息，2013，30（3）：148-150.

[7] 林福林，楊昌云，楊薇薇，等. 中藥白芨的現(xiàn)代研究概況[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（7）：571-573.

[8] 李偉平，何良艷，丁志山. 白芨的應(yīng)用及資源現(xiàn)狀[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30（1）：158-160.

[9] 蔣瑞彬，徐旭棟，藍(lán)小明，等. 野生白及SRAP-PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（2）：353-354.

[10] Jiang F，Li W，Huang Y，et al. Antioxidant，antityrosinase and antitumor activity comparison：the potential utilization of fibrous root part of Bletillastriata（Thunb.）Reichb. f. [J].PloS one，2013，8（2）：e 58004.

[11] 王啟祥，呂修梅，張晉秀. 人參皂苷含量變化研究概況[J]. 西北藥學(xué)雜志，2002，17（5）：233-235.

[12] 孫成賀，王英平. HPLC-ELSD 法測定人參莖、葉、根中7種人參皂苷含量[J]. 特產(chǎn)研究，2009，31（4）：54-55.

[13] 黃愷飛. 藤黃酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中草藥，2010，41（11）：1823-1828.

[14] Reed JC. Double identity for proteins of the Bcl-2 family[J]. Nature，1997，387（6635）：773-776.

[15] Adams JM，Cory S. The Bcl-2 protein family：arbiters of cell survival[J]. Science，1998，281（5381）：1322-1326.

[16] Sarecka-Hujar B，Zak I，Krauze J. Interactions between rs5498 polymorphism in the ICAM1 gene and traditional risk factors influence susceptibility to coronary artery disease[J]. Clin Exp Med，2009，9（2）：117-124.