李 亮，劉安平，周正新，周章武，江樹(shù)連，盛炎炎

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥230031）

有研究表明，軟骨細(xì)胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）關(guān)節(jié)軟骨退變的關(guān)鍵因素之一[1]，軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡，數(shù)量過(guò)少，引起細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變，又使軟骨細(xì)胞的凋亡增加，形成惡性循環(huán)，從而導(dǎo)致OA 的發(fā)生[2]，消腫方是根據(jù)我院骨傷科國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)丁鍔教授根據(jù)“補(bǔ)腎活血利水”法組成的中藥復(fù)方，以補(bǔ)腎活血利水為主，臨床用于治療OA，多年的臨床觀察結(jié)果顯示其有較理想的治療效果[3]。前期研究顯示：補(bǔ)腎活血利水法具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、抑制其凋亡、調(diào)控滑膜組織基因表達(dá)譜及多種細(xì)胞信號(hào)通路等多種作用[4]，為了進(jìn)一步探討其療效機(jī)制，揭示其發(fā)揮療效的藥理作用特點(diǎn)或靶點(diǎn)，本研究通過(guò)建立兔OA 動(dòng)物模型，觀察不同濃度消腫方對(duì)動(dòng)物模型的軟骨細(xì)胞凋亡及同源細(xì)胞群數(shù)量的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 月齡體重2.6～3.2kg 的新西蘭大耳白兔36只，雌雄各半，隨機(jī)分為6 組（模型組、空白組、陽(yáng)性對(duì)照組，中藥消腫方低劑量組（40g/kg）、中劑量組（80g/kg）、高劑量組（160g/kg），每組6 只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（皖）2013-0126。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

Bcl-2、Bax 免疫組化試劑盒和軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2.2 主要儀器

37℃溫箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司 型號(hào)：GNP-9160 型），干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 型號(hào)：DHG-9140 型），石蠟切片機(jī)（Leica2135），BM-Ⅱ型病理組織包埋機(jī)（安徽省電子科學(xué)研究所），ZT-RP 生物組織脫水機(jī)、QP 切片漂烘溫控儀（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司），88-1大功率磁力攪拌器、QT-1 漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司），LX-100 手掌型離心機(jī)（上海市麒麟醫(yī)用儀器廠），Nikon80 熒光顯微鏡（新飛達(dá)光學(xué)儀器公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

消腫方劑生藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房提供（懷牛膝15g，茯苓皮20g，黃芪15g，當(dāng)歸10g，莪術(shù)8g，萆薢10g，紅花2g 組成），將生藥飲片80g 加入920g 水中制備成中劑量組，低、高劑量組分別將生藥飲片40g，160g 加入960、840g水中制備成低、高劑量組；鹽酸氨基葡萄糖規(guī)格：0.24g*28 片/盒，四川新斯頓藥業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為：141004。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模

除空白組外，所有動(dòng)物采用改良Hulth 法[5]制作膝關(guān)節(jié)OA 動(dòng)物模型，麻醉生效后，常規(guī)消毒、鋪巾，取兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)髕旁入路，切開(kāi)皮膚及皮下組織后，內(nèi)側(cè)支持帶及關(guān)節(jié)囊后，將髕骨向外側(cè)脫位，顯露膝關(guān)節(jié)腔，顯露內(nèi)側(cè)半月板及前交叉韌帶，依次切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，切斷前交叉韌帶（改良Hulth 法），再逐層關(guān)閉關(guān)節(jié)囊、皮下組織、皮膚，敷料包扎切口，不予外固定，建模后連續(xù)4d青霉素3×104U 肌肉注射，10d 后開(kāi)始每天強(qiáng)迫兔活動(dòng)40min，連續(xù)6 周。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

隨機(jī)分為6 組后，根據(jù)人與兔體表面積比值，人與兔藥物劑量比值為1/3，分別對(duì)消腫方低劑量組、中劑量組、高劑量組采用40、80g/kg 以及160g/kg 的消腫方煎劑20mL 灌胃，空白組灌服等容積生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌服溶有6 片硫酸氨基葡萄糖的生理鹽水溶液（1d 分3 次），連續(xù)治療4 周。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)方法

1.4.3.1 組織形態(tài)學(xué)檢查

光鏡下觀察軟骨細(xì)胞、軟骨陷窩、軟骨囊、同源細(xì)胞群及軟骨細(xì)胞間質(zhì)形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化，在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個(gè)視野觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)同源細(xì)胞群數(shù)量。

1.4.3.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采用TUNEL 法（原位缺口末端標(biāo)記法）在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個(gè)視野觀察，平均計(jì)數(shù)100 個(gè)軟骨細(xì)胞中細(xì)胞核染色成棕色顆粒的細(xì)胞數(shù)目即為凋亡指數(shù)（AI）。

1.4.3.3 免疫組化檢測(cè)

標(biāo)本石蠟切片，免疫組織化學(xué)染色（三步法）：石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS（磷酸鹽緩沖液）浸泡5min×2 次，5%～10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h 或4℃過(guò)夜。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。顯色劑顯色DAB（磷酸緩沖液）3～15min 自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。在光鏡下觀察Bcl-2 蛋白陽(yáng)性表達(dá)為漿黃色顆粒，試驗(yàn)以己知陽(yáng)性染色切片作為陽(yáng)性陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸緩沖液代替第一抗體作為陰性陽(yáng)性對(duì)照，在400 倍放大率下，任選5 個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算Bcl-2 陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，參數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（HE 染色，10×40 倍）

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 陽(yáng)性對(duì)照組

圖4 治療組（低劑量組）

圖5 治療組（中劑量組）

圖6 治療組（高劑量組）

由圖1-6 可知，空白組：軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列規(guī)則，軟骨陷窩及軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量多，軟骨細(xì)胞間質(zhì)少，模型組：軟骨細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、排列雜亂，軟骨陷窩及軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量很少；軟骨細(xì)胞間質(zhì)很多，治療組：軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)較清晰、排列較規(guī)則，軟骨陷窩及軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量少，軟骨細(xì)胞間質(zhì)多，介于空白組和模型組之間。

2.2 軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量比較

由表1 統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：同一時(shí)間段，在不同組別兩兩比較，高劑量治療組與中劑量治療組相比較時(shí)，P>0.05，4 周時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組與模型組比較時(shí)，P>0.05，8 周及12 周時(shí)中劑量治療組與低劑量治療組相比較時(shí)，P>0.05，其他組別兩兩比較時(shí)，P＜0.05。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：模型組軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量降低，治療后，軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量升高，在治療早期（4周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時(shí)，其升高幅度加大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但經(jīng)過(guò)治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時(shí)，雖升高幅度加大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在各組隨時(shí)間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：空白組（P＜0.05），模型組（P＜0.05），陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），治療組（低劑量組）（P＜0.01），治療組（中劑量組）（P＜0.05），治療組（高劑量組）為0.058，0.003，0.005，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：除高劑量治療組由4 周延長(zhǎng)至8 周時(shí)，軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量增加不明顯外，其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 采用TUNEL 法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)

由表2 可知，在同一時(shí)間軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)隨不同組別變化兩兩比較后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：4 周、8 周、12 周時(shí)P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，而經(jīng)過(guò)中藥消腫方治療后，軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，而且隨中藥劑量增大，其下降幅度加大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在各組隨時(shí)間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：空白組8 周與4周相比，P=0.175，12 周與8 周相比，P=0.025＜0.05，模型組和陽(yáng)性對(duì)照組8 周與4 周相比，P=0.025＜0.05，12 周與8 周相比，P=0.695，在低、中、高劑量治療組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：空白組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)在12 周時(shí)明顯升高，模型組和陽(yáng)性對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)在8 周時(shí)明顯升高，超過(guò)8 周后，升高不明顯，治療后，軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，在各劑量治療組，隨治療時(shí)間由4 周逐漸延長(zhǎng)至8 周、12 周時(shí)，其下降幅度加大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見(jiàn)圖7-12）

表2 軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)

圖7 空白組

圖8 模型組

圖9 陽(yáng)性對(duì)照組

圖10 低劑量治療組

圖11 中劑量治療組

圖12 高劑量治療組

2.4 BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比

由表3 可知，在同一時(shí)間軟骨細(xì)胞BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比隨組別變化兩兩比較后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：4周、8 周、12 周時(shí)P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比最低，隨組別變化至陽(yáng)性對(duì)照組、低、中、高劑量治療組時(shí)，軟骨細(xì)胞BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸升高，而且隨中藥劑量增大，其升高幅度加大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在各組隨時(shí)間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統(tǒng)計(jì)結(jié)果為：空白組12 周與8 周相比，P＜0.05，其余5 組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨時(shí)間延長(zhǎng)，各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（見(jiàn)圖13-18）

表3 BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比

圖13 空白組

圖14 模型組

圖15 陽(yáng)性對(duì)照組

圖16 低劑量治療組

圖17 中劑量治療組

圖18 高劑量治療組

3 討論

OA 發(fā)病率高，是老年人的最常見(jiàn)的慢性關(guān)節(jié)疾病，尤以膝關(guān)節(jié)OA（KOA）常見(jiàn)。北京市區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示60 歲以上老年人膝關(guān)節(jié)X 線OA 患病率女性為42.8%，男性為21.5%；臨床KOA 患病率女性為15%，男性為5.6%[6]。

OA 指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疾病。目前病因尚不明確，其發(fā)生與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳因素等有關(guān)。其病理特點(diǎn)為軟骨蛋白多糖含量減少，導(dǎo)致軟骨破壞，進(jìn)而全層軟骨消失，深達(dá)骨質(zhì)，關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成，軟骨下骨增厚、囊性變、硬化，滑膜呈慢性炎癥改變，同時(shí)滑膜釋放細(xì)胞因子，進(jìn)一步破壞軟骨[7]，其病變涉及整個(gè)滑液關(guān)節(jié)，包括軟骨、滑膜和軟骨下骨、其發(fā)病過(guò)程最主要的特點(diǎn)是以膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為主要病理改變，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化[8]，OA 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，研究表明細(xì)胞外基質(zhì)的降解、軟骨細(xì)胞凋亡等是該病發(fā)生的重要因素。

同源細(xì)胞群是由一個(gè)軟骨細(xì)胞分裂增殖形成的軟骨細(xì)胞群，位于軟骨組織的中部。每個(gè)同源細(xì)胞群有2～8 個(gè)軟骨細(xì)胞，包含在一個(gè)大的軟骨陷窩內(nèi)，后者又分成幾個(gè)小的陷窩，各含一個(gè)軟骨細(xì)胞。軟骨的同源細(xì)胞群深層的軟骨組織內(nèi)軟骨陷窩較少，但形態(tài)較大，內(nèi)含多個(gè)軟骨細(xì)胞，但細(xì)胞較成熟，代謝緩慢，越靠近軟骨的中部，同源細(xì)胞群的數(shù)目越多，反映了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的生長(zhǎng)，同源細(xì)胞群的數(shù)目下降，則表明細(xì)胞外基質(zhì)的降解，目前對(duì)于同源細(xì)胞群數(shù)目的相關(guān)研究較少，因此關(guān)于這方面的研究有待進(jìn)一步開(kāi)展。

軟骨細(xì)胞凋亡在OA 病理過(guò)程中發(fā)揮的作用越來(lái)越受到重視[9]，細(xì)胞凋亡（細(xì)胞程序性死亡）是一個(gè)主動(dòng)的、信號(hào)依賴的過(guò)程，并由基因控制的主動(dòng)的、高度有序的死亡過(guò)程。線粒體凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡、細(xì)胞自噬在OA 的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10]。因此關(guān)于軟骨細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究成為目前的熱點(diǎn)之一。目前有研究表明Bcl-2 家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白中的關(guān)鍵調(diào)因子，其抗凋亡與促凋亡成員協(xié)調(diào)作用[11]，Bcl-2 家族蛋白的一個(gè)顯著特征是具有Bcl-2 同源結(jié)構(gòu)域，主要體現(xiàn)在4個(gè)保守的區(qū)域，即BH1、BH2、BH3、BH4 結(jié)構(gòu)域，典型的抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W 等含有4 個(gè)短的保守的BH 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C 端疏水尾狀結(jié)構(gòu)，即跨膜結(jié)構(gòu)域，這類成員具有抗凋亡活性，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

KOA 屬中醫(yī)“痹證”范疇，是臨床難治性疾病之一，晚期致殘率高，多數(shù)患者最終需要人工關(guān)節(jié)置換以改善功能，所以本病治療的關(guān)鍵在于早期防治[12]，從西醫(yī)來(lái)說(shuō)，即使僅以緩解癥狀、改善功能為目的，也缺少療效更好、不良反應(yīng)更少的治療方法，因此中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎已經(jīng)逐漸受到重視。中醫(yī)對(duì)其認(rèn)識(shí)歷史悠久，治療手段多樣，有臨床效果好、副作用少等優(yōu)勢(shì)[13]。中醫(yī)認(rèn)為中老年膝骨關(guān)節(jié)炎的主要病機(jī)是肝腎不足，氣虛血瘀，虛損與瘀實(shí)并存，虛損為本，成其病，瘀實(shí)為標(biāo)，其病在筋骨，與肝腎密切相關(guān)[14]，消腫方是根據(jù)我院骨傷科國(guó)家級(jí)名老中醫(yī)丁鍔教授根據(jù)“補(bǔ)腎活血利水”法組成的中藥復(fù)方，有補(bǔ)腎利水、活血化瘀之功，對(duì)痰、瘀、水互阻所致的骨關(guān)節(jié)炎能起較好的治療作用[15]。

氨基葡萄糖是構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)源性物質(zhì)，可刺激黏多糖的生化合成及增加骨骼鈣質(zhì)的攝取，以提高骨與軟骨組織的代謝功能和營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)改善與增強(qiáng)滑膜液的黏稠度，增加滑膜液合成，提供關(guān)節(jié)潤(rùn)滑功能，還可阻斷OA 的病理過(guò)程，防止疾病進(jìn)展，抑制和消退關(guān)節(jié)變性形成，從而有效修復(fù)軟骨關(guān)節(jié)，持久緩解疼痛，阻止疾病進(jìn)展，具有優(yōu)越的耐受性和安全性，臨床廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎的治療，是第一個(gè)經(jīng)臨床證明的骨關(guān)節(jié)炎疾病改善藥物[16]，因此在本研究中作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

在制作模型方法上，本研究采用經(jīng)典的改良Hulth 法建立骨關(guān)節(jié)炎家兔模型，通過(guò)切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶造成膝關(guān)節(jié)的不穩(wěn)，使關(guān)節(jié)軟骨承受了異常的機(jī)械壓力，從而導(dǎo)致軟骨退變及破損[17]，并且采取強(qiáng)迫活動(dòng)方式誘導(dǎo)模型建立。兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型中關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)方法，如改良Hulth 法等模型誘導(dǎo)成功率高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用廣泛，特別適用于膝關(guān)節(jié)內(nèi)注藥預(yù)防和減輕OA病理改變的研究[18]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明：空白組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)在12 周時(shí)明顯升高，模型組和陽(yáng)性對(duì)照組軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)在8 周時(shí)明顯升高，超過(guò)8 周后，升高不明顯，而經(jīng)過(guò)中藥消腫方治療后，軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)下降，其下降幅度與治療時(shí)間以及中藥劑量有相關(guān)性，消腫方具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡作用；模型組軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量降低，在治療早期（4 周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時(shí)，其升高幅度加大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但經(jīng)過(guò)治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時(shí)，雖升高幅度加大，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除高劑量治療組由4 周延長(zhǎng)至8 周時(shí)，軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量增加不明顯外，其余各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨時(shí)間延長(zhǎng)，出現(xiàn)軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明消腫方能增加軟骨同源細(xì)胞群數(shù)量，并與治療時(shí)間以及中藥劑量有相關(guān)性；模型組BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比最低，通過(guò)消腫方治療后，軟骨細(xì)胞BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比逐漸升高，表明消腫方能升高BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比，并且其升高幅度與治療時(shí)間以及中藥劑量有相關(guān)性；但其抑制軟骨細(xì)胞凋亡與升高同源細(xì)胞群數(shù)量及BCL-2 陽(yáng)性細(xì)胞百分比內(nèi)在關(guān)系以及是否通過(guò)某些信號(hào)通路發(fā)揮其干預(yù)作用，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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