黃 梅，奚海燕，王 穎，潘 紅，范 明，胡毓安，史利寧，王衛(wèi)萍，邵海楓

·論 著·

耐喹諾酮的銅綠假單胞菌藥物外排泵研究

黃 梅，奚海燕，王 穎，潘 紅，范 明，胡毓安，史利寧，王衛(wèi)萍，邵海楓

目的 探討外排系統(tǒng)在對喹諾酮類藥物耐藥的銅綠假單胞菌中所起的作用。方法 用含亞抑菌濃度（20 mg／L）外排泵抑制劑羰基氰化氯苯腙（carbonyl cyanide 3?chlorophenylhydrazone，CCCP）的MH平板和不含泵抑制劑的MH平板分別檢測對環(huán)丙沙星的MIC值，比較MIC值是否不同；MIC值降低的菌株用RT?PCR檢測外排泵蛋白基因表達量的變化，用PCR和測序法了解調控外排泵蛋白表達的基因是否存在改變。結果 14株銅綠假單胞菌的外排泵存在過度表達，環(huán)丙沙星的MIC值降低至原值的1／2～1／8，以mexAB?OprM和mexCD?OprJ表達增加為主，調控mexAB?OprM基因的MexR有V126E突變，mexCD?OprJ的調控基因NfxB有H109Y突變。結論 外排泵的高表達在喹諾酮耐藥的銅綠假單胞菌中存在近50%，高于所見國內外的報道。該機制與藥物作用靶位改變共同提高了銅綠假單胞菌對喹諾酮類的耐藥，外排泵的高表達同時也提升了該菌對頭孢吡肟等其他藥物的耐藥，是需要密切關注和采取相應措施的流行趨勢。

銅綠假單胞菌；環(huán)丙沙星；左氧氟沙星；耐藥機制；外排系統(tǒng)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染中常見的機會致病菌。在下呼吸道感染和重癥肺炎中該菌作為病原菌是提示預后差的重要指標，尤其是多重耐藥菌株的出現(xiàn)使治療更為棘手。在大型綜合性醫(yī)院，喹諾酮類抗生素往往是治療多重耐藥菌感染的主要藥物，由此導致銅綠假單胞菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率逐年上升，2010年我院耐藥性監(jiān)測顯示銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率分別為37．4%到34．7%，2011年則分別上升至50．3%和48．9%［1］。有報道表明，銅綠假單胞菌對環(huán)丙沙星及氧氟沙星的耐藥率與左氧氟沙星的消耗量密切相關，與環(huán)丙沙星的消耗量相關不密切［2］。

目前認為銅綠假單胞菌對喹諾酮類抗菌藥耐藥機制［3］主要是編碼DNA解旋酶和拓撲異構酶IV的基因發(fā)生突變，導致喹諾酮類藥物作用靶位改變；細胞膜外排泵的高表達是銅綠假單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥的另一因素［4］。銅綠假單胞菌最重要的外排系統(tǒng)屬于RND家族，由3部分組成∶外膜蛋白，如OprM、OprJ、OprN等形成門通道，使藥物進入菌體內；內膜蛋白，如MexB、MexD、MexF、MexY、MexK等，為主要的泵出蛋白，具有識別藥物的作用，但無特異性；連接蛋白，如MexA、MexC、MexE、MexX等，能連接內、外膜蛋白，與其共同形成可能是連序的通道并開口于菌體外。以上3部分可形成MexAB?OprM、MexXY?OprM、MexCD?OprJ、MexEF?OprN等導致銅綠假單胞菌產生耐藥性的主動泵出系統(tǒng)。MexAB?OprM受MexR的負調節(jié)，mexR位于MexAB?OprM操縱子和轉錄叉的上游，mexR突變增加MexAB?OprM的外排泵的表達量，伴發(fā)MDR（多重耐藥）；MexXY?OprM可被抗菌藥物誘導表達，受上游調控基因表達的MexZ負調控，由其過度表達可導致對青霉素、氨曲南、喹諾酮類、氨基糖苷類、紅霉素和四環(huán)素等藥物耐藥。

MexCD?OprJ的操縱子受NfxB負反饋調控，一旦nfxB出現(xiàn)突變，可引起喹諾酮類、大環(huán)內酯類和頭孢吡肟等藥物的交叉耐藥。MexEF?OprN受MexT和MvaT調控與喹諾酮、甲氧芐啶、氯霉素和亞胺培南的外排和總體調控銅綠假單胞菌致病相關。為了了解和證實外排系統(tǒng)在本組菌喹諾酮類藥物耐藥中所起的作用，本研究采用泵抑制、調控基因突變和泵表達量的變化進行研究探討。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012年10－12月收集我院臨床分離的30株銅綠假單胞菌（非重復菌株），標本類型分別為痰液、血液、分泌物、膿液、組織和導管等。入選標準∶Vitek?2 Compact儀，用GN?13藥敏卡檢測，表型為環(huán)丙沙星（CIP）和左氧氟沙星（LEV）耐藥，瓊脂稀釋法復查符合上述表型。質控菌株∶銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.2 儀器和設備 Vitek2?Compact細菌鑒定儀∶法國BioMerieux公司，PCR擴增儀∶德國eppendorf公司，捷達801凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)、Himac?CR21G低溫高速離心機∶日本日立公司，H．SWX 600BS數(shù)顯電熱恒溫水箱∶上海新苗醫(yī)療器械廠，DL?CJ?2N超凈工作臺∶哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司，ABI 7500 real?time PCR system∶美國ABI公司。

1.3 試劑 RNAiso Plus（D9108A）總RNA提取試劑盒∶日本TaKaRa公司，iScriptTNcDNA Synthesis Kit、iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix∶美國Bio?Rad公司，TaqDNA聚合酶（附10×buffer和MgCl2）、dNTPs、DNA Marker∶日本TaKaRa公司，蛋白分子量標準∶加拿大Fermentas公司，瓊脂糖∶美國Promega公司，引物合成與測序∶上海英駿公司。

1.4 方法

1.4.1 含CCCP的MH平板檢測環(huán)丙沙星的MIC值 按美國CLSI（2012）標準瓊脂稀釋法（瓊脂分為含和不含CCCP）檢測和判讀CIP對菌株MIC值。銅綠假單胞菌ATCC 27853為質控菌株，具體方法如下∶①倍比稀釋法制備系列濃度梯度的抗菌藥物溶液，濃度依次為1280、640、320、160，80、 40、20、10、5、2．5、1．2、0．6 μg／mL。②制備200 mg／L CCCP溶液。③M?H瓊脂（CCCP）以蒸餾水配制為85%濃度，高壓后冷卻至56°C左右，每平板加入17 mL及1 mL CCCP溶液和2 mL對應濃度的藥物，總體積為20 mL，CCCP濃度為20 mg／mL，藥物終濃度依次為128、64、32、16，8、4、2、1、0．5、0．25、0．06 μg／mL。不含CCCP的MH藥物瓊脂方法同前，CCCP溶液換為1 mL蒸餾水。④挑取過夜培養(yǎng)的新鮮菌落配置為0．5麥氏單位濁度的菌液。⑤用無菌棉簽接種新鮮配置0．5麥氏單位濁度的菌液到測試的M?H瓊脂平板上，35℃孵箱18～24 h，讀取MIC值。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測外排系統(tǒng)基因表達量 在CCCP存在條件下CIP的MIC值下降的菌株采用qRT?PCR檢測mexA、mexC、mexE和mexX 4種外排基因的表達量。方法如下∶用日本TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒按說明書操作提取細菌的總RNA，再使用Bio?RAD公司的iScriptTNcDNA Synthesis Kit試劑盒按說明書進行總RNA逆轉錄成cDNA，采用iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix試劑盒在ABI 7500 real?time PCR system定量分析外排系統(tǒng)4種基因的mRNA的表達量。所用引物（由上海英駿公司合成）見表1，銅綠假單胞菌（Pa）ATCC 27853為正常對照組，rspl基因為內參基因。反應體系∶20 μL，包括iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix 10 μL，上、下游引物各0．4 μL，雙蒸水7．2 μL，cDNA 2 μL，反應條件∶94℃預變性30 s，94℃5 s，60℃35 s，30循環(huán)；溶解曲線為94℃15 s，60℃1 min，94℃15 s。每個樣品設置3個重復孔，以rpsl基因作為內參基因。結果以2－ΔΔCt表示，其中ΔΔCt＝實驗組－對照組（Ct目的基因－Ctrpsl）（Ct目的基因－Ctrpsl）。外排泵表達判定標準依據文獻［5］報道，mexA大于2倍，mexC、mexE和mexX大于5倍為增加。

1.4.3 外排泵調控基因擴增 對外排泵過度表達的菌株，進行編碼相應調控蛋白基因的擴增和測序。方法如下∶煮沸法提取細菌總DNA作為模板，進行mexR和mexZ和nfxB基因擴增。引物見表1。反應體系∶總反應體系50 μL，按PCR試劑說明書加樣。循環(huán)參數(shù)∶94℃預變性10 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，循環(huán)30次；最后延伸72℃10 min。反應結束后取5 μL PCR產物在15 g／L瓊脂糖中進行凝膠電泳。擴增產物送上海英駿公司測序，測序結果與GenBank數(shù)據庫的相應基因進行比對。

表1 4種外排泵蛋白和調控蛋白基因引物

2 結 果

2.1 CCCP抑制后CIP的MIC值 共有14株菌在含CCCP的MH平板上檢測CIP的MICs值較不含CCCP的MH平板下降為原值的1／2～1／8。泵抑制劑未能降低其他16株菌和質控菌株（ATCC27853）的MIC值，結果詳見表2。

2.2 外排系統(tǒng)基因表達量變化 在上述14株菌中，外排系統(tǒng)mexA、mexC、mexE和mexX 4種外排基因逆轉錄實時定量PCR檢測結果顯示，以mexA和mexC基因表達增加為主，其中2株同時出現(xiàn)mexA和mexC表達量增加（P9、P12）；僅1株mexX高表達，未見mexE基因表達量增加；另有1株菌（P10）4種外排基因均未出現(xiàn)表達量增加。結果見表3。注∶mexA大于2倍，mexX、mex和CmexE大于5倍為增加

表2 14株菌CIP MIC值、外排泵蛋白和調控基因的變化

表3 外排系統(tǒng)基因表達結果

圖1 外排泵調控基因擴增電泳圖

2.3 外排泵調控基因突變 出現(xiàn)外排泵過度表達的14株實驗菌和對照菌銅綠假單胞菌ATCC27853，均擴增出編碼調控蛋白的基因mexR和mexZ和nfxB（圖1），測序結果與基因庫比對顯示，MexAB?OprM高表達的菌株，調控基因mexR 377位U→A的點突變導致MexR蛋白V126E改變；MexXY?OprM高表達的菌株，調控基因mexZ 584位G→A點突變導致MexZ蛋白G195E改變；MexCD?OprJnfxB高表達的菌株，調控基因nfxB 167位A→G點突變導致NfxB蛋白D56G改變，結果見表2。

3 討 論

為了解外排泵的過度表達是否存在于本組喹諾酮類耐藥銅綠假單胞菌中，采用泵抑制劑CCCP抑制外排泵的方法進行CIP的MICs值檢測，篩選出有可能存在外排泵過度表達銅綠假單胞菌。然后再用實時熒光定量PCR檢測外排泵連接蛋白的基因表達量。泵表達量增加的菌株，采用擴增和測序技術分析編碼調控蛋白的基因是否發(fā)生突變，使調控蛋白的阻遏作用喪失。

實驗結果顯示本組實驗菌近一半菌株（46．7%）存在外排泵的過度表達，以MexAB?OprM和MexCD?OprJ型為主。MexAB?OprM過度表達所占菌株數(shù)最多。外排泵高表達的部分菌同時還存在頭孢他啶敏感，而頭孢吡肟的敏感性下降的非高活性頭孢菌素酶介導的耐藥表型，符合外排泵過度表達會同時影響對頭孢吡肟的敏感性報道［9?10］。P28株為唯一出現(xiàn)MexXY?OprM高表達的菌株，用CCCP抑制后CIP的MIC值由耐藥的8 μg／mL降至敏感折點1 μg／mL。相對于野生株較低的MIC值，在CCCP抑制外排泵后CIP的MIC值也達到了敏感折點。P10株未檢測到實驗設定的4種常見外排泵高表達，到目前為止，從銅綠假單胞菌中檢出的外排泵已達9種甚至更多［11］，不排除可能存在其他類型外排泵的高表達。

本項研究表明，我院外排泵的高表達在喹諾酮耐藥的銅綠假單胞菌中存在近50%，外排泵的高表達同時也提升了該菌對頭孢吡肟等其他藥物的耐藥，是需要密切關注和采取對應措施的流行趨勢。另外楊曉燕等［12］首次發(fā)現(xiàn)質粒介導的銅綠假單胞菌對喹諾酮類低水平耐藥。實驗室及時檢出感染菌，提供可靠的藥敏結果，有助于治療方案的選擇［13］。

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Study on the efflux pump of quinolone resistantpseudomonas aeruginosa drugs

HUANG Mei，XI Hai?yan，WANG Ying，PAN Hong，F(xiàn)AN Ming，HU Yu?an，SHI Li?ning，WANG Wei?ping，SHAO Hai?feng． PLA In?stitute of Laboratory Medicine，Nanjing General Hosptial of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective This study aims to investigate the efflux system in fluoroquinolone resistance of pseudomonas aerugino?sa．Methods MIC values of ciprofloxacin were detected by MH flat containing sub?inhibitory concentration（20 mg／L）efflux pump inhibitor carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone（carbonyl cyanide 3?chlorophenylhydrazone，CCCP）and MH flat without CCCP．Then compare the MIC．Results Efflux pump in 14 strains of pseudomonas aeruginosa was overexpressed，which were mainly mexAB?OprM and mexCD?OprJ．MIC value of ciprofloxacin decressed 1／2－1／8 times．MexR regulated by mexAB?OprM existed V126E muta?tion and NfxB regulated by mexCD?OprJ existed H109Y mutation．Conclusion The efflux pump is overexpressed in nearly 50%of flu?oroquinolone resistant strains of pseudomonas aeruginosa，which is higher than the domestic and foreign reports．The mechanism and drug target change improve the resistance of pseudomonas aeruginosa to fluoroquinolones．The overexpression of efflux pump also en?hance the resistance of the bacteria to cefepime and other drugs（this is not listed），which need us pay close attention and take meas?ures to control this trend．

pseudomonas aeruginosa；ciprofloxacin；levofloxacin；efflux system；resistance mechanis

R96

A

10．3969／j．issn．1672?271X．2015．06．007

∶2015?10?10；

∶2015?10?21）

210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍檢驗醫(yī)學研究所

（本文編輯∶齊 名； 英文編輯∶王建東）