李曉莉，丁 璐，陳 炎，歐東波，曾 迪，鄭強蓀

(第四軍醫(yī)大學 唐都醫(yī)院 心血管內科，陜西 西安710038)

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研究論文

PMA體外誘導小鼠多能干細胞向心肌細胞的分化

李曉莉#，丁 璐#，陳 炎，歐東波，曾 迪，鄭強蓀*

(第四軍醫(yī)大學 唐都醫(yī)院 心血管內科，陜西 西安710038)

目的研究丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)對小鼠誘導多能干細胞體外分化為心肌細胞的影響，以建立一種高效安全的體外誘導iPSC分化為心肌細胞的實驗方法。方法用懸滴法形成擬胚體(EBs)，PMA誘導其向心肌細胞定向分化。免疫細胞學標記檢測心肌肌鈣蛋白T(cTnT)和α橫紋肌輔肌動蛋白(α-actinin)的表達；RT-PCR和q-PCR檢測Brachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5和GATA4等mRNA的表達。以添加相應DMSO作為對照組，觀察各組出現(xiàn)搏動擬胚體的數(shù)量，計算分化比率。結果PMA 誘導小鼠誘導多能干細胞分化為心肌細胞的最佳濃度為100 nmol/L，此時擬胚體搏動率可達53%，顯著高于對照組(12%),且PMA誘導產生的心肌細胞表達多種心肌蛋白及基因, 具有心肌細胞的結構特征。結論PMA能夠促進miPSC在體外定向分化為心肌樣細胞。

多能干細胞；心肌細胞；丙二醇甲醚醋酸酯；分化

目前人工生物心臟被認為是一種治療心臟損傷最有希望的途徑和方式，但體外構建人工生物心臟，必須制備大批量、同質性心肌細胞。原代心肌細胞由于其極低的增殖能力，無法滿足大批量制備的要求；而干細胞來源的心肌細胞則成為解決這一難題的最好選擇[1]。但多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)在體外自然分化為心肌細胞的能力較低，因此尋找一種有效的誘導方法具有重要意義。丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol- 12-myristate- 13-acetate, PMA)作為一種蛋白激酶C通路的激活劑,具有促進細胞增殖以及心肌肥大的作用，且目前已有研究表明PMA可以誘導脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)分化為心肌細胞[2- 4]。但PMA是否具有促進iPSC向心肌細胞分化的作用卻鮮有報道。不同種類的細胞有明顯的異質性，相同誘導刺激在不同細胞會表現(xiàn)出不同誘導效應，因此對于PMA在多能干細胞的誘導效應還需進一步研究。本實驗研究PMA對小鼠誘導多能干細胞(mouse induced pluripotent stem cells, miPSC)體外分化為心肌細胞的影響，以期建立一種高效安全的體外誘導iPSC分化為心肌細胞的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞和動物來源:小鼠誘導多能干細胞(miPSC)(中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿教授)，該細胞帶有表達綠色熒光的OCT4基因，在未分化時表達綠色熒光，隨著分化的進行熒光量減少，據(jù)此可以跟蹤細胞的分化狀態(tài)。西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心SPF級ICR小鼠：體質量18～22 g(許可證號：SCXK(陜)2012- 003)。

1.1.2 主要試劑：KnockOutTM-DMEM培養(yǎng)基、KnockOutTM血清替代品和TRizol(Invitrogen 公司)；高糖 DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺衍生物、非必需氨基酸、PBS、胎牛血清和0.5% Trypsin-EDTA(Gibco公司)；丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)、B-巰基乙醇、Trixon-100、多聚甲醛和絲裂霉素C(Sigma公司)； 白血病抑制因子(LIF, Chemicon公司)；抗體心肌肌鈣蛋白T(cardiac Troponin T, cTnT)和α橫紋肌輔肌動蛋白(α-Sarcomeric actinin, α-actinin) (Abcam 公司)；RT-PCR試劑盒(Promega公司)；牛血清白蛋白(西安國安生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)溶液配制：胚胎成纖維細胞培養(yǎng)基配置：90%高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺的衍生物; miPSC 細胞培養(yǎng)基配制：85% KnockOutTM-DMEM培養(yǎng)基+15% KnockOutTM血清替代品+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺的衍生物+0.1 mmol/L β-巰基丙醇+1 000 U/mL白血病抑制因子; miPSC心肌分化培養(yǎng)基配制：80%高糖 DMEM培養(yǎng)基+20%胎牛血清+0.1 mmol/L非必需氨基酸+2 mmol/L谷氨酰胺的衍生物。

1.2.2 小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層的制備:實驗選用懷孕13.5 d的ICR小鼠，分離獲得小鼠胚胎成纖維細胞，具體方法見參考文獻[5]。

1.2.3 miPSC的培養(yǎng)及誘導分化:復蘇miPSC，以4×105個/皿的細胞密度接種到處理好的MEF飼養(yǎng)層中，37 ℃孵育培養(yǎng)。將狀態(tài)較好且未分化的miPSC 細胞用0.05%胰蛋白酶細胞消化液消化為單個細胞，差速貼壁去除飼養(yǎng)層細胞，收集、計數(shù)。用miPSC 心肌分化培養(yǎng)基配成細胞密度為(2～3)×104個/mL的細胞懸液，以20 μL/滴，滴至培養(yǎng)皿上蓋內表面，懸滴培養(yǎng)3 d形成肉眼可見的白色顆粒狀物體(擬胚體)。然后用滴管吸取擬胚體接種于0.1%明膠覆蓋的培養(yǎng)皿中，在貼壁2～6 d，加入含不同濃度PMA(1、5、10 20、50 100、150和200 nmol/L)的miPSC心肌分化培養(yǎng)基, 以添加DMSO作為對照組, 比較各組之間心肌細胞的誘導效率(圖1)。

圖1 小鼠iPSC 細胞誘導培養(yǎng)時間流程Fig 1 Protocol for cardiomyocyte differentiation of miPSC

1.2.4 免疫細胞化學染色：miPSC誘導分化15 d后，消化傳代，種于載玻片上貼壁24 h，進行免疫熒光染色，具體步驟見參考文獻[6]。一抗?jié)舛萩TnT(1∶200)、α-actininn(1∶200)。

1.2.5 RT-PCR鑒定：為了動態(tài)檢測miPSC 細胞向心肌分化的過程，誘導組細胞在分化-3、0、1、3、5、7、9、12和15 d用Trizol提取總RNA，測定RNA濃度，以總體積20 μL, RNA樣品1 μg的體系，參照試劑盒(oligo(dT)18primer and a RevetAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit)反應條件進行反轉錄合成cDNA, 進行PCR測定多能性標志基因OCT4、Nanog，中胚層標志基因Brachyury和心肌細胞標志基因cTnT、GATA4、NKX2.5MLC2v和MLC2a的表達。PCR 引物序列見表1。1.2.6 Quantitative real-time PCR測定：在分化第2～6 d加入100 nmol/L PMA和相應DMSO，分化第15天收集細胞提取RNA, 反轉錄合成cDNA。參照試劑盒(Thermo Scientific Maxima SYBR Green qPCR Master Mixes)進行q-PCR測定誘導組和對照組心肌特異性基因的表達情況。以GAPDH作為對照，通過2-ΔΔCt算法進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 miPSC形態(tài)觀察及鑒定

明膠上miPSC與胚胎干細胞 (embryonic stem cell, ESC) 細胞形態(tài)相類似，細胞呈集落樣生長、集落致密且邊緣整齊、細胞形態(tài)較小、核質比高、增殖迅速、倍增時間短。綠色熒光蛋白轉基因(OCT4)小鼠來源的miPSC在熒光顯微鏡下觀察, 呈現(xiàn)出與光學顯微鏡對應的集落狀綠色細胞團(圖2)。

2.2 EB分化過程形態(tài)學觀察

miPSC 懸滴培養(yǎng)3 d，形成擬胚體后，進行貼壁誘導分化。隨著擬胚體的不斷分化，兩組圓形擬胚體逐漸平鋪生長，在邊緣也出現(xiàn)圓球形、梭型或多邊形細胞，細胞間交織成網(wǎng)，逐漸形成細胞團(簇)(圖3)。在貼壁誘導第7天，誘導組觀察到自發(fā)搏動的細胞團，而對照組到貼壁誘導第9天才觀察到有自發(fā)搏動細胞團的出現(xiàn)，且在誘導分化12 d時，各組搏動細胞團數(shù)均達到峰值，其后各組搏動細胞團數(shù)未見增加。

2.3 優(yōu)化PMA最佳誘導濃度

在貼壁誘導第2～6天，添加不同濃度PMA(0～200 nmol/L)，比較了分化12 d時各組之間EB的搏動率。在0～100 nmol/L濃度區(qū)間內，PMA的誘導分化率隨濃度增加而增加，在PMA濃度達到100 nmol/L 時達到峰值，之后隨PMA濃度增加其誘導效率開始下降；PMA誘導miPSC 向心肌細胞分化的最佳濃度為100 nmol/L，且在PMA濃度20～200 nmol/L濃度區(qū)間內，PMA的誘導分化形成的心肌細胞的搏動率均顯著高于對照組(圖4)。

2.4 q-PCR檢測對照組與誘導組心肌基因的表達

在分化2～6 d加入100nmol/L PMA和相應DMSO，在分化15 d時誘導組心肌特異性基因cTnT、NKX2.5、GATA4、MLC2c和MLC2a的表達均顯著高于對照組(圖5)。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers of PCR

圖2 小鼠iPSC細胞形態(tài)

圖3 PMA誘導miPSC 細胞向心肌分化進程中形態(tài)學光察

Data were collected at day 12;*P<0.05，**P<0.01 compared with control圖4 不同濃度PMA對miPSC 分化為心肌樣細胞的影響Fig 4 Concentration-dependent relationships of PMA(n=3)

*P<0.01 compared with control圖5 分化15 d后對照組和誘導組心肌特異性基因的表達情況Fig 5 Quantitative RT-PCR analysis indicated the increased expression of cardiac gene(n=3)

2.5 免疫熒光染色

miPSC誘導分化15 d，分化形成的心肌細胞胞質中cTnT、α-Sarcomeric actinin表達陽性，且呈現(xiàn)出的清晰的肌絲和肌節(jié)結構(圖6)。

2.6 RT-PCR檢測心肌分化期間各基因的表達情況

miPSC在PMA的作用下，隨著分化進行干細胞標志基因OCT3/4和Nanog的表達均不斷減少；中胚層標志基因Bracyury在分化第3天時出現(xiàn)表達，隨后減弱消失。而心肌細胞標志基因cTnT等均在第5天均出現(xiàn)表達，隨后逐漸增強(圖7)。

nuclei were counterstained with DAPI (blue)

*P<0.05，**P<0.01 compared with -3 day

3 討論

iPS細胞是近年來通過體細胞重編程獲得的類似于胚胎干細胞的誘導多能干細胞。與胚胎干細胞不同，iPS細胞由于避免了胚胎干細胞所帶來的倫理及免疫排斥問題，相較于胚胎干細胞更具臨床應用價值。但iPS細胞本身帶有其原始細胞的部分記憶效應，其體外分化為其他細胞的能力弱于胚胎干細胞。尋求高效穩(wěn)定的分化方法成為誘導干細胞定向分化為心肌細胞的一個重要研究方向。目前體外促進干細胞向心肌細胞分化的方法有很多，包括化學誘導劑、共培養(yǎng)等[7- 9]，而化學誘導劑由于價格低廉，劑量濃度易于控制，成為了最為常用的誘導方法，目前運用較多的化學誘導劑如二甲基亞砜[10]、5-氮胞苷[11]、維生素C[12]、wnt信號分子[13]。

PMA作為一種蛋白激酶C通路的激活劑,具有促進細胞增殖以及心肌肥大的作用，且目前已有研究表明PMA可以誘導ADSCs分化為心肌細胞，但是對其是否具有促進多能干細胞向心肌細胞分化的作用卻鮮有報道。不同種類的細胞有明顯的異質性，相同誘導刺激在不同細胞會表現(xiàn)出的不同誘導效應，若直接將適用于ADSCs細胞的方案應用到miPSC 上是有困難的，因此對于PMA在多能干細胞的誘導效應還需進一步研究。

本實驗以PMA為誘導劑，研究了其對小鼠誘導多能干細胞體外分化為心肌細胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在分化2～6 d時添加PMA，誘導組自發(fā)搏動細胞團出現(xiàn)較對照更早，且搏動數(shù)量顯著高于對照。PMA濃度分析結果發(fā)現(xiàn)，PMA最佳誘導濃度為100 nmol/L，此時心肌細胞誘導效率高達53%，且PMA濃度在20～200 nmol/L范圍內，其分化效率與對照相比顯著增加。q-PCR結果也表明心肌特異性標志基因Nkx2.5,GATA4,cTnT,MLC2a和MLC2c在誘導組的表達均高于對照組。免疫細胞化學技術結果顯示, 分化得到的心肌細胞表達心肌特異蛋白cTnT和α-actinin，且呈現(xiàn)出的清晰的肌絲和肌節(jié)結構。RT-PCR研究表明PMA誘導分化miPSC，在第3天分化形成中胚層，第5天即分化形成心肌細胞，隨后其心肌細胞逐漸增加。

綜上所述，PMA可以促進小鼠誘導多能干細胞體外分化為心肌細胞，顯著提高 miPSC 向心肌細胞分化的效率，建立了一種高效安全的體外誘導miPSC分化為心肌細胞的實驗方法，為構建具有心肌組織特性和收縮功能的人工心肌打下基礎。

志謝：感謝中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿教授提供小鼠誘導多能干細胞。

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新聞點擊

健康生活可抗衰老

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年9月18日報道，一項小型研究證實，健康生活方式有助人體細胞抗衰老。包括食用以植物為主的未加工健康食品(whole food)、每日適度運動、做瑜伽放松身體及減輕壓力。

研究對象為35名男子，要求其中10人遵從這樣的生活方式；另外25人沒有要求他們改變生活方式。在飲食和每日身心鍛煉活動以外，這10人每周還參加由專家設計的加強新技巧課程，為期3個月。

經過5年后，科學家評量參與研究人員的細胞老化標記，也就是“端?！?telomere)。這個位于染色體末端的蛋白質可在細胞分裂時協(xié)助保護DNA鏈。端粒的長度與細胞的壽命有關。在10人小組里，端粒的長度在5年內平均增加達10%，且嚴謹遵從新生活方式的參與者增加最多。但對照組中端粒的長度平均縮短3%。

領導這項研究的加利福尼亞大學舊金山分校(UCSF)教授歐尼希(Dean Onish)說：“如經大規(guī)模隨機控制實驗證實此研究結果，廣泛生活方式改變可能大幅降低許多疾病和早逝的風險?！?/p>

此研究刊登于《柳葉刀·腫瘤學》(The Lancet Oncology)期刊上。

DNA修復機制展現(xiàn)治癌新契機

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年9月12日報道，一個跨國團隊合作研究發(fā)現(xiàn)，PIF1解旋酶可解開DNA雙螺旋，有效地幫助DNA復制，達到基因修復功能。研究人員認為，了解PIF1解旋酶修復DNA作用機制，對藥物與臨床應用會有很大幫助，希望能從基礎研究帶到癌癥應用。

同源重組(homologous recoombination)是基因修復非常重要的機制，同源重組過程中，PIF1解旋酶能有效地解開DNA雙螺旋，協(xié)助DNA聚合酶進行DNA復制及完成斷裂DNA的修復。研究團隊利用酵母菌進行實驗發(fā)現(xiàn)，在正常PIF1解旋酶存在情況下，酵母菌可以很有效地修復細胞DNA損傷，但如果PIF1解旋酶突變，修復效果就大幅降低。

2011年一項研究顯示，在不使用藥物情況下，抑制癌細胞的PIF1解旋酶可使癌細胞生存率降低10倍。使用化療藥“健澤”后，癌細胞中存有正常PIF1解旋酶，對藥物忍受度較高，PIF1解旋酶被抑制住，癌細胞則顯著死亡，顯見抑制PIF1解旋酶可抑制癌細胞生長。

研究人員認為，研究提供了PIF1解旋酶作用機制，未來希望能用來篩查癌癥患者、發(fā)展標靶藥物治療癌癥，也希望能建立藥物篩查平臺，發(fā)展PIF1抑制劑。

這項研究是第一次結合遺傳學與生物化學找出PIF1解旋酶參與DNA修復以及作用機制。研究結果刊登在《自然》(Nature)期刊上。

Phorbol myristate acetate promotes differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytesinvitro

LI Xiao-li#, DING Lu#, CHEN Yan, OU Dong-bo, ZENG Di, ZHENG Qiang-sun*

(Dept. of Cardiology, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China)

Objective To investigate the effect of PMA on the differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into cardiomyocytesinvitro, and to establish an efficient and safe protocol for cardiac differentiationinvitro. Methods Embryoid bodies (EBs) were prepared by classical hanging drop method, and were differentiated to cardiomyocyte with PMA treatment; Furthermore, expression of cardiac troponin T and α-Sarcomeric actinin was observed by immunofluorescent staining, mRNA expression levels of the related genesBrachyury,cTnT,MLC2a,NKX2.5,GATA4 were analyzed by qPCR and RT-PCR.Control group was treated by DMSO, number of beating embryoid bodies was calculated. Results The best concentration of PMA to induce the cardiac differentiation of miPSC was 100 nmol/L and the beating area was found in 53% of embryoid bodies, compared with the control group (beating area was found in 12% of embryoid bodies), Differentiation efficiency was higher in PMA treatment group. IPS-CM expressed serve cardic related proteins and genes, and had the Structure characteristics of myocardium cell. Conclusions PMA can promote miPSC to differentiate into cardiomyocyteinvitro.

iPSC; cardiomyocyte; PMA; differentiate

2014- 10- 23

2014- 12- 30

國家自然科學基金(31271039； 31400832)

1001-6325(2015)04-0463-07

Q254

A

*通信作者(corresponding author)： zhengqiangsun@yeah.net

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