包宜俊，楊存滿，李　穎，陸光華

(淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室,河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,南京　210098)

活性污泥胞外聚合物與雙氯芬酸的相互作用

包宜俊，楊存滿，李穎，陸光華

(淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點實驗室,河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院,南京210098)

利用三維熒光光譜和紅外光譜方法，研究活性污泥胞外聚合物與雙氯芬酸之間的相互作用?？疾炝藀H、電導(dǎo)率和不同離子對兩者之間相互作用的影響。結(jié)果表明：胞外聚合物的熒光峰強度隨著雙氯芬酸的加入而被猝滅，二者間結(jié)合常數(shù)值(lgK)為3.28～4.90。胞外聚合物與雙氯芬酸結(jié)合會導(dǎo)致胞外聚合物原有的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)：pH的變化可以增強兩者的結(jié)合，有助于雙氯芬酸在污水處理過程中的去除，而電導(dǎo)率和不同離子對體系的影響并不明顯。

胞外聚合物；雙氯芬酸；三維熒光光譜；結(jié)合作用

雙氯芬酸(Diclofenac，DCF)作為非甾體消炎類藥物，能夠通過抑制前列腺素合成而起到消炎止痛作用, 被廣泛使用[1]。研究表明DCF進入人體后大部分會以原型或代謝產(chǎn)物的形式排放到環(huán)境中[2]，而DCF的代謝產(chǎn)物容易在污水處理過程中裂解成原型排放到環(huán)境水體中。文獻報道DCF在污水處理廠中的去除效率在21%～40%之間[3]，因此DCF在自然水體中檢出率很高，給人體健康和環(huán)境安全帶來威脅。Sui[4]等檢測北京兩個污水處理廠尾水中DCF的殘留濃度為0.035～0.46 μg/L。Wang[5]等人在調(diào)查黃河、海河及遼河中的酸性藥物殘留時發(fā)現(xiàn)DCF有較高的檢出率，最高濃度達到717 ng/L。Zhao[6]等人在珠江流溪河、石井河以及珠江河段的地表水中也檢測出DCF，最高濃度為150 ng/L。

胞外多聚物(extracellular polymeric substance，EPS)是微生物在生長和代謝過程中產(chǎn)生的一類高分子物質(zhì)，它覆蓋在微生物細胞表面及填充在污泥絮體內(nèi)部空隙中，維持著污泥的結(jié)構(gòu)和功能的完整性，在活性污泥系統(tǒng)中起著極其重要的作用。EPS主要由大分子有機物質(zhì)組成，如腐殖質(zhì)類、多聚糖類、蛋白類和核酸類，組成非常復(fù)雜。EPS表面具有大量的活性官能團和疏水區(qū)域，具有極大的吸附和絡(luò)合能力[7]，能夠通過吸附和絡(luò)合作用與菲、苯、腐殖酸和染料等有機污染物結(jié)合，從而將污染物從水體中去除[8]。由于雙氯芬酸的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，EPS與雙氯芬酸間能夠發(fā)生相互作用，從而影響雙氯芬酸在水體中的遷移過程。但是，目前為止二者的相互作用機制尚不清楚，環(huán)境條件對二者作用影響還未見報道。本研究利用三維激發(fā)發(fā)射矩陣熒光(Three-dimensional excitation-emission matrix，EEM)、同步熒光及傅里葉紅外光譜方法研究了活性污泥胞外聚合物與雙氯芬酸的相互作用機制，探討胞外聚合物在雙氯芬酸遷移和去除過程中所起的作用，為強化雙氯芬酸在活性污泥系統(tǒng)中的去除提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

雙氯芬酸(純度大于99%)購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。蒽酮試劑，酒石酸鈉溶液，F(xiàn)ulin酚試劑，甲醇，離子交換樹脂(Cation exchange resin, CER)均為分析純，購于南京榮華科學(xué)器材有限公司。

電導(dǎo)率儀(雷磁，DSJ-308A，上海)，高速冷凍離心機(湘智，TGL-16M，長沙)，熒光光譜儀(Hitachi，F(xiàn)7000，日本)，紫外可見分光光度計(Hach，Alpha-1506，美國)，傅里葉紅外光譜儀(Bruker，Tensor27，德國)。

1.2實驗方法

1.2.1EPS提取與測定

采自南京市江寧城市污水處理廠二沉池的活性污泥用離子交換樹脂法提取活性污泥胞外聚合物。將50 mL活性污泥懸浮液置于離心管中以5000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，離心后舍棄上清液，用50 mL NaCl溶液 (0.1 mol/L)洗滌兩次。將洗滌過的污泥懸浮液置于50 mL的磷酸緩沖溶液(pH 7.0)中。處理的污泥混合液轉(zhuǎn)移至提取容器中，同時加入一定量的離子交換樹脂(60g/g)，在4oC下連續(xù)攪拌6h提取EPS。提取結(jié)束后將離子交換樹脂/污泥的混合液靜置3 min，保證離子交換樹脂完全沉淀。將上層提取液在4oC下以10000 r/min速度離心30 min，得到的上清液用0.45 μm醋酸纖維素膜過濾，濾液即為EPS溶液。最后將該溶液在60oC干燥箱中烘干得到EPS固體。

EPS中多糖采用蒽酮比色法測定[9]，用葡萄糖作為標準。蛋白質(zhì)和腐殖酸采用改進Lowry法測定[10]，分別用牛蛋白血清與腐殖酸作為標準。

1.2.2三維熒光光譜分析

將從300 ml活性污泥中提取的EPS固體用磷酸緩沖溶液配制成濃度為200 mg/L的儲備液。移取5 mL EPS溶液加入到一系列10 mL比色管中，同時在每個比色管中加入的不同體積DCF溶液(1.0 g/L)，用磷酸緩沖液定容至10 mL。為了保證EPS與DCF充分結(jié)合，溶液振蕩2h后進行三維熒光以及同步熒光測定。設(shè)置對照實驗和平行實驗，測試結(jié)果取平均值。

三維熒光光譜激發(fā)波長和發(fā)射波長范圍均為200～500 nm；激發(fā)和發(fā)射狹縫設(shè)為2.5 nm；掃描速度為12000 nm/min。三維熒光光譜采用Origin8.0等高線圖繪制。

1.2.3紅外光譜分析

為了研究EPS結(jié)合DCF的構(gòu)型變化，采用紅外光譜方法對EPS的構(gòu)型進行分析。在配有DTGS KBr檢測器和衰減全反射 (ATR)附件的Bruker，Tensor 27型FT-IR光譜儀進行紅外光譜測定。所有光譜利用ATR方法記錄，并在相同分辨率4.0 cm-1，掃描6次收集紅外光譜。采用儀器自帶軟件采集數(shù)據(jù)，Origin8.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2　結(jié)果與討論

2.1EPS與DCF結(jié)合機制

三維熒光用于分析EPS與DCF間的作用機制。所用活性污泥每g VSS(可揮發(fā)性懸浮物)中EPS含量為124.0 mg/g。圖1為活性污泥EPS與DCF作用前后的三維熒光譜圖。從圖1中可以看出DCF本身并沒有熒光吸收峰，而活性污泥EPS有3個熒光吸收峰，分別為峰A(Ex/Em=230 nm/300 nm)、峰B(Ex/Em=240 nm/350 nm)和峰C(Ex/Em=270 nm/370 nm)。峰A位于Ⅰ區(qū)(含芳環(huán)基團的類蛋白物質(zhì)Ⅰ)，峰B位于Ⅱ區(qū)(含芳環(huán)基團的蛋白質(zhì)Ⅱ區(qū))。峰C位于Ⅳ區(qū)(溶解性微生物副產(chǎn)物)[11]。峰A、峰B和峰C都屬于類蛋白峰，與EPS中的芳環(huán)氨基酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。由圖1可知，EPS的熒光強度隨著DCF濃度的增加不斷降低。當DCF濃度達到25 mg/L時，峰C消失，峰A和峰B的位置發(fā)生了明顯的紅移。EPS熒光強度的降低和熒光峰位置的變化表明，活性污泥EPS中的類蛋白物質(zhì)和DCF發(fā)生了作用，EPS本身結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖1　EPS-DCF體系的三維熒光光譜圖Fig.1　EEM fluorescence spectra of EPS -DCF system

熒光猝滅可以反映EPS本身結(jié)構(gòu)的變化。通常引起熒光猝滅的機制分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。為了研究EPS與DCF的熒光猝滅機制，使用Stern-Volmer方程[12]對猝滅機制進行分析：

(1)

式中F0和F分別為DCF加入前后EPS所測得的熒光強度；KSV為猝滅常數(shù)；kq為生物分子猝滅速率常數(shù)；τ為分子的熒光壽命，通常對于生物大分子τ值為1.0×10-8s；c為加入DCF濃度。

圖2　EPS-DCF體系的Stern-Volmer曲線Fig.2　Stern-Volmer plots of EPS -DCF system

基于靜態(tài)猝滅的機理，利用修正的Stern-Volme方程[13]和Ryan-Weber非線性模型[14]對EPS與DCF作用強度(即結(jié)合常數(shù))進行計算。修正的Stern-Volmer方程:

(2)

式中f是滴定前后熒光的變化值占初始熒光強度的比例，K為結(jié)合常數(shù)。

Ryan-Weber非線性模型：

(3)

式中假設(shè)未加入DCF時EPS的熒光強度為100。F是EPS與對應(yīng)濃度DCF結(jié)合后的熒光強度相對初始熒光強度的百分值；Fend為滴定達到理論終點時的熒光強度相對初始熒光強度的百分值。K為結(jié)合常數(shù)；c為加入DCF濃度；cL為EPS中配體L的總濃度。

表1 是修正的Stern-Volmer方程和Ryan-Weber非線性模型擬合出的不同峰的結(jié)合常數(shù)。兩種模型擬合得到的結(jié)果表明：EPS中的類酪氨酸(A峰)結(jié)合DCF的強度要大于其它類蛋白峰。計算得到的結(jié)合常數(shù)雖小于金屬離子與EPS的結(jié)合常數(shù)，但與有機污染物的結(jié)合常數(shù)相近[15]?；贓PS與DCF較高的結(jié)合強度，并能生成穩(wěn)定的EPS-DCF絡(luò)合物說明活性污泥中的EPS能夠?qū)ξ鬯锾幚磉^程中DCF的遷移和歸趨產(chǎn)生影響。

表1　EPS-DCF體系的結(jié)合常數(shù)(lg K)值

2.2EPS結(jié)合DCF的結(jié)構(gòu)變化

同步熒光是由Liody[16]提出的，包括固定激發(fā)和發(fā)射波長差，獲得固定的Δλ。同步熒光不僅能保持高的靈敏度還有簡化譜峰，減小峰寬及降低其它物質(zhì)的干擾等優(yōu)點。利用同步熒光光譜進一步探討活性污泥中EPS與DCF結(jié)合后其自身結(jié)構(gòu)的變化。通過測定EPS與DCF作用后最大發(fā)射波長的位移，可以研究EPS的結(jié)構(gòu)變化。由于EPS主要是由類蛋白質(zhì)組成，當Δλ為60 nm時，同步熒光可以得到色氨酸殘基的特性。從圖3可以看出，隨著DCF濃度增加，EPS同步熒光光譜強度有規(guī)律的減弱，同時在340 nm處的同步熒光譜峰發(fā)生明顯的紅移，表明色氨酸殘基周圍極性增強。由于DCF進入蛋白中色氨酸殘基位于的疏水區(qū)域，導(dǎo)致肽鏈伸展，從而使色氨酸暴露在水溶液中。色氨酸殘基處于相對親水的微環(huán)境中，使得同步熒光峰發(fā)生紅移[17]。這一結(jié)果表明EPS官能團與DCF之間結(jié)合，改變了EPS自身的結(jié)構(gòu)。

圖3　EPS-DCF體系的同步熒光光譜 (Δλ=60 nm)Fig.3　Synchronous fluorescence spectra of EPS- DCF system (Δλ=60 nm)

圖4顯示了EPS結(jié)合DCF前后的紅外光譜。分析結(jié)合之前的EPS紅外譜圖，存在強烈的蛋白和多糖吸收峰，較弱的羧酸類和酚類吸收峰。圖中3800～3000 cm-1為EPS中蛋白和多糖的羥基伸縮振動[18]，2360 cm-1左右為NH的伸縮振動。1650 cm-1和1540 cm-1的強烈吸收為蛋白中酰胺Ⅰ(主要是C=O伸縮振動)和酰胺Ⅱ(C-N伸縮振動和-N-H變形振動)[19]。與EPS相比，加入DCF后EPS紅外譜圖發(fā)生了微弱的變化，主要是EPS酰胺I峰從1650 cm-1移至1635 cm-1，2360 cm-1峰強增強。由此可見，DCF與EPS的結(jié)合使EPS的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。其可能的原因DCF與EPS中的C=O和C-N或-N-H基團結(jié)合。

圖4　EPS-DCF體系的紅外譜圖Fig.4　FT-IR spectra of EPS -DCF system

2.3環(huán)境因素對EPS-DCF結(jié)合強度的影響

2.3.1pH對EPS-DCF結(jié)合強度的影響

在反應(yīng)體系中設(shè)定了3、4、5、6、7、8、9 不同的pH值，探討了pH值對EPS-DCF體系熒光猝滅作用的影響，其結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯?，當pH值在3～5時，EPS熒光強度顯著增強；當pH值在5-9時，EPS熒光強度趨于穩(wěn)定。EPS-DCF體系與EPS的熒光強度隨pH值的變化趨勢一致，且在pH=8時達到最大。因此，選取對熒光強度影響較大的pH=8計算EPS-DCF結(jié)合強度。從表2中數(shù)據(jù)可知，在pH值為8時，兩種模型擬合所得的lgK值與之前相比均有顯著增大，說明EPS與DCF的結(jié)合作用增強。這可能是由于pH改變了體系中相關(guān)官能團如酚羥基和羧基的構(gòu)型，從而導(dǎo)致了結(jié)合作用的改變[20]。

圖5　pH值對EPS和EPS-DCF體系熒光強度的影響Fig.5　Fluorescence emission intensity of EPS and EPS-DCFsystem at different pH

2.3.2離子強度對EPS-DCF結(jié)合強度的影響

電導(dǎo)率對EPS-DCF體系熒光猝滅作用的影響如圖6所示。不同電導(dǎo)率情況下，反應(yīng)體系的熒光強度沒有顯著差異。表明離子強度對EPS與EPS-DCF體系沒有顯著影響。為了進一步驗證，選取電導(dǎo)率2800 μs/cm計算結(jié)合常數(shù)。從表2中數(shù)據(jù)可知，兩種模型擬合得到的lg K值與之前數(shù)據(jù)無明顯變化。

圖6　電導(dǎo)率對EPS和EPS-DCF體系熒光強度的影響Fig.6　Fluorescence emission intensity of EPS and EPS-DCF system at different conductivity

2.3.3無機離子對EPS-DCF結(jié)合強度的影響

選取城市污水中檢出率較高的3種金屬離子Ca2+、Al3+、Fe3+，研究其對EPS-DCF反應(yīng)體系熒光猝滅作用的影響，結(jié)果由表2所示。從中可知，兩種模型下3種金屬離子的存在均使lgK值稍有改變。其中峰C的結(jié)合常數(shù)與之前相比變化最為顯著，且結(jié)合常數(shù)均增大，表明金屬離子在一定程度上能促進EPS與DCF的結(jié)合。

表2　環(huán)境因素對EPS-DCF體系結(jié)合常數(shù)影響

3　結(jié)　論

利用多種分析方法研究了活性污泥中EPS與雙氯芬酸DCF的相互作用機制。通過修正的Stern-Volmer方程和Ryan-Weber非線性模型擬合EPS-DCF體系的熒光數(shù)據(jù)得到的結(jié)合常數(shù)值表明EPS與DCF間存在較強的結(jié)合作用。這一結(jié)果說明水相中的DCF能夠被活性污泥分泌的EPS有效的富集。同步熒光光譜和紅外光譜分析結(jié)果表明兩者結(jié)合后，EPS蛋白組成結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。同時，研究不同環(huán)境條件對體系結(jié)合強度的影響發(fā)現(xiàn)，pH的增加能夠使EPS-DCF體系結(jié)合作用增強，金屬離子在一定程度上能促進EPS與DCF的結(jié)合作用，而電導(dǎo)率對EPS-DCF體系的影響不大。

[1]Cuklev F, et al. Diclofenac in fish: blood plasma levels similar to human therapeutic levels affect global hepatic gene expression [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2011, 30(9): 2126-2134.

[2]Heberer T. Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data [J]. Toxicology letters, 2002, 131(1): 5-17.

[3]Zhang Y, et al. Carbamazepine and diclofenac: removal in wastewater treatment plants and occurrence in water bodies [J]. Chemosphere, 2008, 73(8): 1151-1161.

[4]Sui Q, et al. Seasonal variation in the occurrence and removal of pharmaceuticals and personal care products in different biological wastewater treatment processes [J]. Environmental science & technology, 2011, 45(8): 3341-3348.

[5]Wang L, et al. Occurrence and risk assessment of acidic pharmaceuticals in the Yellow River, Hai River and Liao River of north China [J]. Science of the Total Environment, 2010, 408(16): 3139-3147.

[6]Zhao J L, et al. Occurrence and a screening‐level risk assessment of human pharmaceuticals in the Pearl River system, South China [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2010, 29(6): 1377-1384.

[7]Lindberg R H, et al. Screening of human antibiotic substances and determination of weekly mass flows in five sewage treatment plants in Sweden [J]. Environmental science & technology, 2005, 39(10): 3421-3429.

[8]Sheng G P, et al. Characterization of adsorption properties of extracellular polymeric substances (EPS) extracted from sludge [J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 62(1): 83-90.

[9]Dubois M, et al. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances [J]. Anal Chem, 1956, 28(3): 350-356.

[10]Lowry O C. Protein measurement with the Folin phenol reagent [J]. Journal of Biological Chemistry, 1951, 193(1): 265-275.

[11]魏群山, 等. 天然水體溶解性有機物(DOM)分級組分對典型城市源污染的熒光響應(yīng) [J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2010, (10): 1229-1235.

[12]Fang F, et al. A spectrofluorimetric study of the binding of carbofuran, carbaryl, and aldicarb with dissolved organic matter [J]. Analytica chimica acta, 1998, 373(2): 139-151.

[13]馮啟言, 等. 煤礦區(qū)廢水中溶解性有機質(zhì)與銅的結(jié)合特性 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2013, 33(8): 1433-1441.

[14]Wu F, et al. Fluorescence quenching of fulvic acids by fullerene in water [J]. Environmental Pollution, 2013, 172:100-107.

[15]X P, et al. Binding of phenanthrene to extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic activated sludge: a fluorescence study [J]. Colloids Surf B Biointerfaces, 2010, 80(1): 103-106.

[16]Lloyd J B F. Synchronized Excitation of Fluorescence Emission Spectra [J]. Nature, 1971, 20: 64.

[17]Bi S, et al. Investigation of three flavonoids binding to bovine serum albumin using molecular fluorescence technique [J]. Journal of Luminescence, 2012, 132(1): 132-140.

[18]Guibaud G, et al. Comparison of the complexation potential of extracellular polymeric substances (EPS), extracted from activated sludges and produced by pure bacteria strains, for cadmium, lead and nickel [J]. Chemosphere, 2005, 59(5): 629-638.

[19]Al-qadiri H M, et al. Rapid detection and identification of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as pure and mixed cultures in bottled drinking water using Fourier transform infrared spectroscopy and multivariate analysis [J]. Journal of agricultural and food chemistry, 2006, 54(16): 5749-5754.

[20]梅毅, 等. 運用3DEEMs及熒光偏振方法研究pH,離子強度及濃度效應(yīng)對腐殖酸熒光光譜特性的影響 [J]. 地球化學(xué), 2008, 37(2): 165-173.

Interaction between Diclofenac and Extracellular Polymeric Substance Extracted from Sludge

BAO Yi-jun, YANG Cun-man, LI Yin, LU Guang-hua

(KeylaboratoryofIntegratedRegulation&ResourcesDevelopmentofShallowLakesofMinistryofEducation,CollegeofEnvironment,HohaiUniversity,Nanjing, 210098,China)

In this study, three-dimensional fluorescence spectrometry and infrared spectroscopy were used to identify the interactions between extracellular polymeric substance (EPS) and diclofenac (DCF). Effects of pH, conductivity and different ions on the binding strength between EPS and DCF were investigated. The results showed that the 3D fluorescence signal peaks of EPS could be quenched by the addition of DCF. The binding constants (lgK) of EPS were 3.28～4.90. Infrared and Synchronous fluorescence spectra indicated the structure of EPS had been changed by DCF. Under different environmental conditions, the complexation could be enhanced by pH, it helps to remove DCF during wastewater treatment process. However, the influence of conductivity and different ions on the system is not obvious.

EPS; diclofenac; three-dimensional fluorescence spectrum; binding

2015-05-11

國家自然科學(xué)基金(51209068,51479067);江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。

包宜俊(1991-),男,江蘇鎮(zhèn)江人,河海大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程專業(yè)2013級在讀碩士研究生,主要從事環(huán)境污染化學(xué)研究。

李穎，hj6688@hhu.edu.cn。

X703

A

1001-3644(2015)06-0023-06