申菲菲，郭睿，趙樹鵬，齊鳳杰△，孟翠麗

線粒體分裂在甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞增殖、凋亡以及侵襲中的作用

申菲菲1，郭睿2，趙樹鵬3，齊鳳杰1△，孟翠麗1

目的研究線粒體動力學(xué)蛋白Mfn2和Drp1在甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞中的表達(dá)和線粒體分裂抑制劑-1 （Mdivi-1）對SW579細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。方法采用RT-PCR檢測Mfn2和Drp1 mRNA，Western blot檢測Mfn2和Drp1蛋白在Nthy-ori 3-1和SW579兩種細(xì)胞中的表達(dá)；然后將SW579分為對照組（DMSO，0.1%）和Mdivi-1低、中、高劑量組（濃度分別為15、30、45 μmol/L），培養(yǎng)16 h，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的變化，用熒光分光光度計檢測線粒體膜電位的變化，用RT-PCR檢測細(xì)胞色素C（Cyt C）和Caspase-3 mRNA的變化，Western blot檢測Cyt C和Caspase-3蛋白的變化，用Transwell小室侵襲實驗檢測侵襲能力的變化。結(jié)果與Nthy-ori 3-1細(xì)胞系相比，SW579細(xì)胞系中Mfn2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與對照組相比，Mdivi-1各組SW579細(xì)胞存活率和線粒體膜電位均明顯降低，Cyt C和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增加，侵襲能力明顯減弱（均P＜0.01），并且呈藥物濃度依賴性。結(jié)論甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞中存在線粒體動力學(xué)異常，Mdivi-1可以抑制此細(xì)胞的增殖和侵襲，并能誘導(dǎo)其凋亡。

甲狀腺腫瘤；癌，鱗狀細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；線粒體動力學(xué)；Mdivi-1；Mfn2；Drp1

甲狀腺癌是最常見內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，近年來，我國甲狀腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而且其復(fù)發(fā)率和死亡率較高，這導(dǎo)致其治療難度明顯增加［2］。以前大量研究證實癌癥中存在線粒體功能改變，針對恢復(fù)線粒體的功能或者促進(jìn)線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡等線粒體靶向治療是提高癌癥治療效果的重要方法。最近越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)線粒體動力學(xué)在腫瘤生物學(xué)中也發(fā)揮著非常重要的作用［3-5］。線粒體動力學(xué)包括線粒體融合與分裂。在哺乳動物細(xì)胞中，Mfn1/2以及Opa1參與了線粒體外膜和內(nèi)膜融合的調(diào)控，而Drp1和Fis1是控制線粒體外膜分裂的重要分子［6］。雖然已有研究證實在肺癌和乳腺癌存在著線粒體動力學(xué)變化［4，7］，但目前尚鮮見有關(guān)線粒體動力學(xué)在甲狀腺癌中的報道。本文旨在檢測SW579細(xì)胞系中線粒體動力學(xué)蛋白變化以及不同濃度的線粒體分裂抑制劑-1（Mdivi-1）對其增殖能力、線粒體膜電位、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)及其侵襲能力的影響。

1　材料與方法

1.1實驗材料 （1）實驗細(xì)胞。SV40大T抗原永生化人正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori 3-1購自英國HPACC細(xì)胞中心，甲狀腺鱗癌細(xì)胞系SW579，購于上海生命科學(xué)院細(xì)胞和生物化學(xué)研究所。（2）主要試劑。L15培養(yǎng)液（大連寶生物公司），RMPI 1640培養(yǎng)基（Hyclone公司），Mdivi-1（Sigma-Aldrich公司），二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司），線粒體膜電位檢測JC-1試劑盒（C2006）和RIPA裂解液（P0013B）均購自碧云天公司，Mfn2 Antibody（H-68），Drp1 Antibody（H-300），細(xì)胞色素C（Cyt C）Antibody（H-104），Caspase-3 Antibody（H-277），β-actin Antibody（C4），goat anti-rabbit IgG-HRP均購自santa?cruz；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Trizol RNA提取試劑盒和Prime Script RT-PCR Kit（Cat No. DRR014A，大連寶生物公司）。（3）主要儀器。24孔Transwell小室（Corning，costar），Matrigel（BD公司），全自動酶標(biāo)儀和電泳儀（Bio-Rad公司），高速冷凍離心機（Eppendorf公司），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司），熒光分光光度計970CRT（上海分析儀器總廠），-80℃超低溫冰箱（Thermo公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組甲狀腺鱗癌細(xì)胞系SW579置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，飽和濕度、37℃、5%CO2的條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。SV40大T抗原永生化人正常甲狀腺細(xì)胞系Nthy-ori 3-1的培養(yǎng)條件與SW579細(xì)胞系相同。2種細(xì)胞系均2～3 d換液1次，3～5 d傳代1次，當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時以1×105個/mL濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，24 h后待細(xì)胞貼壁后檢測Mfn2、Drp1。選取貼壁后SW579細(xì)胞系，將其用胰酶消化、重懸后計數(shù)并分為對照組（DMSO，0.1%）和Mdivi-1組，其中Mdivi-1組再分為3個亞組：低劑量組（15 μmol/L）、中劑量組（30 μmol/L）和高劑量組（45 μmol/L），每組設(shè)6個復(fù)孔。先根據(jù)培養(yǎng)基體積算出各組所需的DMSO體積和Mdivi-1質(zhì)量，然后將兩者混合充分溶解，24 h后待細(xì)胞貼壁后，分別加入所配好的Mdivi-1溶液至培養(yǎng)基中，使Mdivi-1終濃度分別為0（對照組）、15、30、45 μmol/L，每組DMSO終濃度為0.1%，連續(xù)處理SW579細(xì)胞16h，然后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.2RT-PCR檢測以1×105個/mL濃度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，待24 h細(xì)胞貼壁后給藥處理16 h，然后參照Trizol RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RNA含量測定。當(dāng)A260/A280比值達(dá)1.9～2.1時可用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。參照Prime Script RT-PCR Kit說明書上的操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA及PCR擴(kuò)增過程。引物序列見表1。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照，應(yīng)用EDAS290凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度測量，以每一樣品與其內(nèi)參GAPDH灰度比值表示目的基因mRNA表達(dá)水平。

Tab.1　RT-PCR primer sequences and the expected fragment sizes表1　RT-PCR引物序列及片段大小

1.2.3Western blot檢測用RAPI裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度后于10%或者15%SDS-PAGE上電泳分離，上樣量為30 μg，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；1% BSA室溫封閉1 h，再分別用Mfn2一抗（1∶1 000）、Drp1一抗（1∶1 000）、Cyt-C一抗（1∶500），Caspase-3（1∶500）和β-actin一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜；TBST 5 min×3次；然后用山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h；再TBST 5 min×3次；用增強型ECL化學(xué)液發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)曝光。用Image J軟件求出Drp1、Mfn2、Cyt-C和β-actin的灰度值，并求出Drp1、Mfn2、Cyt-C與β-actin的比值，以反映Drp1、Mfn2、Cyt-C蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞存活率按每孔100 μL種于96孔板，每孔含1×104細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔。待24 h細(xì)胞貼壁后給藥處理16 h，每孔加入15 μL MTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后棄孔中液體，每孔加入150 μL DMSO，37℃避光孵育30 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀吸光度（A）值，根據(jù)A值計算出細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實驗組A570-調(diào)零孔A570）/（對照組A570-調(diào)零孔A570）×100%。以上實驗重復(fù)6次。

1.2.5線粒體膜電位檢測參照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書中的懸浮細(xì)胞線粒體膜電位檢測方法，用熒光分光光度計對各組線粒體膜電位進(jìn)行檢測。按每孔100 μL種于96孔板，每孔含1×105細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔。待24 h細(xì)胞貼壁后給藥處理16 h，然后將各組SW579細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。37℃孵育結(jié)束后，600×g 4℃離心4 min，沉淀細(xì)胞。用1 mL JC-1染色工作液重懸細(xì)胞，600×g 4℃離心4 min，沉淀細(xì)胞，棄上清，重復(fù)上述重懸洗滌過程一次。最后用適量JC-1染色工作液重懸并進(jìn)行檢測。

1.2.6Transwell小室侵襲實驗將Transwell小室放入24孔板孔洞中，小室內(nèi)為上室，24孔板孔洞為下室，中間有聚碳酸酯膜相隔，在聚碳酸酯膜上室側(cè)鋪蓋基質(zhì)膠（Matrigel）。待24 h細(xì)胞貼壁后給藥處理16 h，然后從各組中取1×105個SW579細(xì)胞用100 μL無血清的RPMI 1640重懸后加入上室；下室放置500 μL含10%FBS的RPMI 1640，37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，當(dāng)下室底部出現(xiàn)穿過Transwell上小孔的癌細(xì)胞時，對下室側(cè)癌細(xì)胞進(jìn)行HE染色。在光鏡下計數(shù)穿過聚碳酸酯膜腫瘤細(xì)胞數(shù)，然后計算出侵襲率［8］。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組之間比較采用t檢驗；多組之間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SW579和Nthy-ori 3-1細(xì)胞Mfn2和Drp1表達(dá)水平比較與Nthy-ori 3-1細(xì)胞相比，SW579細(xì)胞中Mfn2 mRNA及蛋白明顯降低，Drp1 mRNA及蛋白明顯升高（均P＜0.01），見圖1、表2。

2.2Mdivi-1對SW579細(xì)胞系增殖能力、線粒體膜電位和侵襲能力的影響與對照組相比，Mdivi-1各組細(xì)胞存活率、線粒體膜電位均明顯降低，侵襲率明顯減弱（均P＜0.01），且呈藥物濃度依賴性，見表3。

2.3Mdivi-1對SW579細(xì)胞系中CytC、Caspase-3表達(dá)水平的影響與對照組相比，Mdivi-1各組中CytC和Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高（均P＜0.01），且呈藥物濃度依賴性，見圖2、表4。

3　討論

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，占癌癥死亡的0.20%，占所有惡性腫瘤的3.00%［9-10］。近年來，我國甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。目前大量研究證實線粒體動力學(xué)參與了癌癥的調(diào)控，而且抑制線粒體分裂對癌癥的增殖，侵襲轉(zhuǎn)移有著明顯的抑制作用［3-5，7］。雖然近年來對甲狀腺癌分子發(fā)病機制有了深入的研究，但是目前尚鮮見有關(guān)線粒體動力學(xué)在甲狀腺癌調(diào)控中的報道。

Fig.1　The transcription and expression levels of Mfn2，Drp1 mRNA （A）and protein（B）in SW579 and Nthy-ori 3-1 cell lines圖1　SW579和Nthy-ori 3-1細(xì)胞中Mfn2、Drp1的mRNA及蛋白表達(dá)

Tab.2　The transcription and expression of Mfn2，Drp1 mRNA and protein in SW579 and Nthy-ori 3-1 cell lines表2　SW579和Nthy-ori 3-1細(xì)胞中Mfn2、Drp1的mRNA及蛋白表達(dá)水平?。╪=6，±s）

Tab.2　The transcription and expression of Mfn2，Drp1 mRNA and protein in SW579 and Nthy-ori 3-1 cell lines表2　SW579和Nthy-ori 3-1細(xì)胞中Mfn2、Drp1的mRNA及蛋白表達(dá)水平　（n=6，±s）

＊＊P＜0.01

細(xì)胞系Nthy-ori 3-1 SW579 t mRNA Mfn2 0.92±0.10 0.47±0.06 9.471＊＊Drp1 0.46±0.09 0.96±0.11 8.602＊＊蛋白Mfn2 0.70±0.09 0.33±0.07 10.666＊＊Drp1 0.62±0.06 1.33±0.17 19.795＊＊

Tab.3　The effects of Mdivi-1 with different concentrations on proliferation，mitochondrial membrane potential and invasion rate in SW579 cell lines表3　不同濃度Mdivi-1對SW579細(xì)胞細(xì)胞存活率、線粒體膜電位和侵襲率的影響?。╪=6，±s）

Tab.3　The effects of Mdivi-1 with different concentrations on proliferation，mitochondrial membrane potential and invasion rate in SW579 cell lines表3　不同濃度Mdivi-1對SW579細(xì)胞細(xì)胞存活率、線粒體膜電位和侵襲率的影響　（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.01；表4同

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F細(xì)胞存活率（%）98.17±1.24 82.50±5.50a65.83±6.24ab50.67±4.67abc17.875＊＊線粒體膜電位5.31±0.32 3.85±0.33a2.03±0.36ab0.95±0.18abc244.275＊＊遷移細(xì)胞（個/104）572.83±45.68 384.67±33.08a249.67±27.15ab137.23±29.92abc146.061＊＊

線粒體是一個動態(tài)變化的細(xì)胞器，不斷地進(jìn)行移動，融合與分裂，這些過程統(tǒng)稱線粒體動力學(xué)［11］。目前多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)線粒體動力學(xué)失調(diào)與癌癥之間存在明顯的相關(guān)性［5］。Rehman等［4］在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中發(fā)現(xiàn)Mfn2明顯降低和Drp1明顯升高，與鄰近的非癌組織相比，肺癌組織樣本中Mfn2表達(dá)量明顯降低，Drp1的總量和磷酸化水平明顯升高，這些結(jié)果表明肺癌組織中線粒體呈分裂趨勢。最重要的是，當(dāng)他們把癌細(xì)胞中線粒體分裂情況逆轉(zhuǎn)之后，體內(nèi)和體外癌細(xì)胞的生長均受到明顯地抑制。與之類似的是，Zhao等［7］研究表明Drp1介導(dǎo)的線粒體分裂參與了乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)。

Fig.2　The effects of Mdivi-1 with different concentrations on the expression and transcription of CytC，Caspase-3 mRNA（B）and protein（B）in SW579 cell lines圖2　不同濃度Mdivi-1對SW579細(xì)胞系中CytC、Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響

Tab.4　The effects of Mdivi-1 with different concentrations on the expression and transcription of CytC，Caspase-3 mRNA and protein in SW579 cell lines表4　不同濃度Mdivi-1對SW579細(xì)胞系中CytC、Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響?。╪=6，±s）

Tab.4　The effects of Mdivi-1 with different concentrations on the expression and transcription of CytC，Caspase-3 mRNA and protein in SW579 cell lines表4　不同濃度Mdivi-1對SW579細(xì)胞系中CytC、Caspase-3的mRNA及蛋白表達(dá)的影響　（n=6，±s）

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F mRNA CytC 0.17±0.03 0.37±0.05a0.52±0.06ab0.77±0.06abc128.716＊＊Caspase-3 0.15±0.06 0.35±0.05a0.58±0.07ab0.88±0.09abc169.030＊＊蛋白CytC 0.18±0.05 0.72±0.07a1.01±0.09ab1.80±0.08abc557.586＊＊Caspase-3 0.11±0.04 0.42±0.05a0.82±0.06ab1.04±0.07abc299.312＊＊

本研究發(fā)現(xiàn)SW579細(xì)胞系較Nthy-ori 3-1細(xì)胞系中Drp1核酸和蛋白水平均表達(dá)明顯升高，Mfn2核酸和蛋白水平均表達(dá)顯著降低，表明甲狀腺鱗癌SW579細(xì)胞系中可能存在著線粒體分裂過度和線粒體融合受抑制現(xiàn)象，提示線粒體動力學(xué)異?？赡茉诩谞钕侔┌l(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移方面有重要作用［5］，這支持了Inoue-Yamauchi［3］和Rehman等［4］的研究。

Mdivi-1是一種喹諾酮類衍生物，可以通過抑制Drp1的GTP酶活性來抑制線粒體分裂［12］。目前Mdivi-1被廣泛用于多種疾病的治療中，如急性腎損傷，心肌局部缺血/再灌注損傷和帕金森病等［12］，但是在癌癥治療方面研究較少。Inoue-Yamauchi等［3］用siRNA抑制線粒體分裂蛋白Drp1后CytC表達(dá)量增多，大腸癌細(xì)胞凋亡明顯增加。Rehman等［4］的體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)Mdivi-1可以抑制肺癌細(xì)胞生長，這提示抑制癌細(xì)胞中線粒體分裂對癌癥的治療起到重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1能濃度依賴性抑制SW579細(xì)胞增殖，這可能與抑制癌細(xì)胞線粒體分裂，進(jìn)而抑制細(xì)胞G1/S過渡期后的順利進(jìn)行，最終抑制了細(xì)胞增殖［13］；線粒體膜電位對線粒體正常功能維持是很重要的［14］。線粒體膜電位的降低是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件［4］。本研究發(fā)現(xiàn)Mdivi-1能誘導(dǎo)SW579細(xì)胞系的線粒體膜電位降低，促進(jìn)了CytC和Caspase-3核酸及蛋白水平的高表達(dá)，這表明Mdivi-1可能通過抑制線粒體過度分裂，降低線粒體膜電位，促進(jìn)線粒體促凋亡因子CytC的表達(dá)，導(dǎo)致Caspase-3表達(dá)增多，最終促進(jìn)了SW579癌細(xì)胞凋亡［3-4］。值得注意的是，本研究還顯示Mdivi-1能濃度依賴性地抑制SW579細(xì)胞系的侵襲轉(zhuǎn)移能力，這可能是由于Mdivi-1通過抑制癌細(xì)胞中線粒體分裂來減少線粒體數(shù)目，并且抑制線粒體重分布到細(xì)胞邊緣，抑制細(xì)胞板狀偽足的形成，最終對細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用［15］。這些結(jié)果提示靶向抑制甲狀腺癌組織中線粒體分裂蛋白Drp1可能是治療甲狀腺癌的一個新方法，但是抑制線粒體分裂是否對甲狀腺癌動物模型也發(fā)揮著類似的作用有待進(jìn)一步證實。

綜上，Mdivi-1能濃度依賴性地抑制SW579細(xì)胞增殖及侵襲并誘導(dǎo)其凋亡，這提示線粒體分裂可能參與了甲狀腺癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的調(diào)控，為甲狀腺癌的機制及治療研究提供一種新的思路。抑制甲狀腺癌細(xì)胞中線粒體分裂有望成為治療甲狀腺癌的重要手段。

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（2014-08-24收稿2014-10-20修回）

（本文編輯李國琪）

Effects of mitochondrial fission in proliferation，apoptosis and invasion of thyroid squamous carcinoma cell line SW579

SHEN Feifei1，GUO Rui2，ZHAO Shupeng3，QI Fengjie1△，MENG Cuili1
1Department of Pathology，Liaoning Medical University，Liaoning 121001，China；2 Department of Pathology，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University；3 Department of General Surgical，the First Affiliated Hospitals of Liaoning Medical University
△Corresponding AuthorE-mail:qifj2005@163.com

ObjectiveTo detect the expression of mitochondrial dynamics proteins（Mfn2 and Drp1）in thyroid squa?mous carcinoma cell line SW579 and the effects of Mitochondrial division inhibitor，Mdivi-1，on proliferation，apoptosis and invasion of SW579.MethodsIn SW579 and Nthy-ori 3-1 cell lines，the expression levels of Mfn2 and Drp1 were deter?mined by western blot while the transcription level of Mfn2 and Drp1 mRNA were measured by RT-PCR.Then，SW579 cells were divided into control group（DMSO，0.1%）and Mdivi-1 low，medium and high dose groups（Mdivi-1 of 15，30 and 45 μmol/L were incubated with cells for 16 hours respectively）.Then the ability of cell proliferation was detected using MTT assay，the mitochondrial membrane potential was determined by fluorescence spectrophotometer，the expression levels of cy?tochrome C and Caspase-3 were quantified by Western blot and the transcription level of the Cyt C and Caspase-3 mRNA were determined by RT-PCR.The ability of invasion in each group was measured with Transwell assays.ResultsCom?pared with Nthy-ori 3-1，the mRNA transcription and protein expression levels of the Mfn2 was remarkably decreased，while the mRNA transcription and protein expression of the Drp1 was significantly increased in SW579 cells（P＜0.01）. Compared with control group，the cell survival rates and mitochondrial membrane potential of SW579 were decreased dramat?ically（P＜0.01）.The mRNA transcription and protein expression of the cytochrome C and Caspase-3 were increased dra?matically（P＜0.01）and the capability of invasion was markedly decreased in all the Mdivi-1 groups in a dosage dependent manner compared with those in control groups（P＜0.01）.ConclusionAbnormal mitochondrial dynamics may be involved in thyroid squamous cell carcinoma SW579 cells；Mdivi-1 can inhibit the cell proliferation and invasion as well as induce apoptosis.

thyroid neoplasms；carcinoma，squamous cell；cell proliferation；apoptosis；mitochondrial dynamics；Mdivi-1；Mfn2；Drp1

R736.1

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.005