劉 佳，魏 明，涂 玲，梁穎紅，龔艷杰，張宜花

（鄭州大學第五附屬醫(yī)院輸血科，河南鄭州450052）

創(chuàng)傷是臨床常見的危重癥之一，特別是免疫／炎性反應的失控，促炎細胞因子的大量釋放和抗炎反應過度強烈均可導致多器官功能障礙綜合征（MODS）［1－3］。創(chuàng)傷后機體在出現(xiàn)全身炎癥反應綜合征（SIRS）的同時，常伴隨免疫功能障礙，主要表現(xiàn)為T 淋巴細胞功能抑制，這是創(chuàng)傷患者發(fā)生繼發(fā)感染和膿毒癥的重要原因［4］。髓源抑制細胞（MDSCs）是一群具有共同特性的高度異質性細胞的總稱，包括未成熟粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和髓系祖細胞等。其共同特性為缺乏成熟髓系細胞標志，具有抑制T 淋巴細胞的功能［5］。MDSCs是免疫系統(tǒng)重要的調節(jié)性細胞，在維持機體免疫系統(tǒng)平衡中起重要作用，它的變化和功能異常與腫瘤免疫逃逸和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關［6－7］。膿毒癥動物模型外周血、骨髓和脾臟中MDSCs數(shù)量明顯增加，是膿毒癥發(fā)生時T 細胞功能障礙和免疫抑制的關鍵性機制［8－9］，創(chuàng)傷后MODS患者外周血中其水平的變化及臨床意義鮮見報道。為此本研究對創(chuàng)傷后MODS患者外周血MDSCs（CD14－CD11b＋CD33＋細胞）的表達進行了檢測，并對MDSCs的表達與細胞因子水平、創(chuàng)傷嚴重程度評分及患者預后的關系進行了分析，旨在進一步揭示MDSCs在創(chuàng)傷后MODS免疫抑制功能中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2014年10月鄭州大學第五附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科收治并診斷為MODS的66例患者作為MODS組，診斷符合1995年全國危重病急救醫(yī)學學術會議制訂的MODS 病情分期的診斷標準和嚴重程度評分標準［10］及SIRS和膿毒癥診斷符合美國胸科醫(yī)師協(xié)會／危重病醫(yī)學會（ACCP／SCCM）制定的標準［11］，剔除合并腫瘤、自身免疫性疾病等疾病的患者。其中男35 例、女31 例，年齡19～67歲，平均（41±12）歲。原發(fā)疾病包括胸部創(chuàng)傷20例，腹部實質臟器損傷18例，腹部空腸臟器損傷20 例，骨關節(jié)損傷8 例。選取同期于本院住院的非MODS患者78例（非MODS組），其中男44例、女34例，年齡18～68歲，平均（42±13）歲。另外選取，37例同期于本院進行健康體檢者作為健康對照組，其中男21例、女16例，年齡20～69歲，平均（42±13）歲，均無近期感染、自身免疫性疾病等。各組間在年齡、性別構成方面進行比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。按照醫(yī)院倫理委員會要求，所有參與研究者簽署知情同意書。MODS病例隨訪至出院或死亡，以死亡或存活判定預后，最終死亡18例，生存22例。

1.2 儀器與試劑 主要檢測儀器為美國BD 公司的FACS Canto流式細胞儀。試劑：人CD11b－FITC 抗體、CD14－PE 抗體、CD33－cy5抗體以及上述抗體相應的同型對照抗體均購自美國BD 公 司；白 細 胞 介 素－10（IL－10）和 腫 瘤 壞 死 因 子－α（TNF－α）檢測試劑盒分別為法國Diaclone公司，鄭州豫興生物技術有限公司產品。

1.3 方法 MODS患者在入院后24h內進行MODS評分。MODS組于確診當日，非MODS組于留院觀察第1日抽取外周靜脈血6mL，平均分為2份。3mL EDTA 抗凝血參照文獻［4］用于CD14－CD11b＋CD33＋檢測；另3 mL 非抗凝血以3 000r／min，離心10min后分離提取血清標本，置于－70 ℃超低溫冰箱保存待測，血清用于IL－10和TNF－α濃度的測定。采用流式細胞術檢測外周血MDSCs表達，流式細胞術參照文獻［12］的方法進行。采集患者外周血（EDTA 抗凝）后混勻，取100μL 全 血，加 入CD11b－FITC 抗 體、CD14－PE 抗 體、CD33－Cy5抗體各2μL，冰上避光孵育30 min，PBS洗滌，紅細胞裂解液裂解、洗滌、固定、重懸后，用流式細胞儀進行檢測，BDFACSDiva軟件分析數(shù)據。ELISA 檢測外周血細胞因子水平，按照試劑盒說明書進行，檢測血清IL－10和TNF－α水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以表示，兩獨立樣本的比較，服從正態(tài)分布者用t或校正t（t′）檢驗，不服從正態(tài)分布者用Wilcoxon秩和檢驗。外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達率與疾病嚴重程度評分、血清IL－10、TNF－α水平的相關性分析采用Pearson相關分析。預后及影響因素分析采用Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MODS患者血清IL－10和TNF－α水平變化 MODS組患者 血清IL－10［（55.65±8.67）pg／mL］、TNF－α［（60.23±34.14）ng／L］水平與 非MODS 組IL－10［（41.12±6.89）pg／mL］、TNF－α［（28.76±21.53）ng／mL］水平比較及與健康對照組IL－10［（30.04±5.72）pg／mL］、TNF－α［（20.87±10.64）ng／mL］水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MODS組死亡患 者 血 清IL－10［（78.6023±15.74）pg／mL］和TNF－α［（89.72±38.91）ng／L］水平高于存活組患者IL－10［（40.45±8.41）pg／mL］和TNF－α［（63.64±24.23）ng／L］水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞的表達MODS組患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達百分率為（11.86±2.18）%，與非MODS組的（6.52±0.37）%和健康對照組的（1.18±0.22）%比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MODS組死亡患者CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達百分率為（15.66±1.68）%，高于存活組患者的（9.48±1.56）%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達與疾病嚴重程度評分、血清IL－10、TNF－α水平的相關性 MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達百分率與TNF－α水平和MODS評分成正相關性（r分別為0.342 6、0.387 9，P＜0.05），與IL－10水平無相關性（P＞0.05）。

2.4 MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達與衰竭器官個數(shù)關系 以MODS 患者的衰竭器官個數(shù)進行分組（分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組），各組外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達百分率均隨衰竭器官個數(shù)增加而升高，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同衰竭器官數(shù)患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達率

2.5 外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達與MODS預后的關系 采用Logistic 回歸分析判斷外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達與MODS患者預后的關系，結果顯示CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達的相對比值比（OR）為0.78，95%可信區(qū)間（CI）為0.72～0.91，P＝0.04。

2.6 影響MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達的因素 對影響MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達因素的Logistic回歸分析顯示，嚴重創(chuàng)傷、嚴重感染和器官衰竭個數(shù)均是影響患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達的因素，見表2。

表2 影響MODS患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達的因素分析

3 討 論

創(chuàng)傷、SIRS、MODS、多器官功能衰竭（MOF）、死亡作為創(chuàng)傷并發(fā)癥的演變過程已達成共識［13］。創(chuàng)傷后并發(fā)癥如感染、ARDS和MODS等的發(fā)生率及病死率居高不下，主要原因是上述并發(fā)癥發(fā)展速度極快。特別是病情發(fā)展到MOF階段，即使采取最及時的治療措施都難以遏止其發(fā)展進程［14］。因此如能早期實施干預措施，對逆轉并發(fā)癥的演變和降低病死率都有重要意義。

創(chuàng)傷后機體常繼發(fā)SIRS和膿毒癥，出現(xiàn)免疫功能紊亂，表現(xiàn)為包括抗原呈遞細胞（APC）和T 細胞等多種免疫細胞功能障礙，輔 助 性T 細 胞（Th）向Th2 方 向 分 化 等［15］。MDSCs是機體免疫系統(tǒng)重要的調節(jié)性細胞，在維持機體免疫系統(tǒng)平衡中起重要作用［5］。有文獻報道，人類MDSCs表型各不相同，但迄今為止報道最多的MDSCs表型為CD14－CD11b＋CD33＋HLA－DR－［2］。為 此，筆 者 采 用CD14－CD11b＋CD33＋作 為MDSCs的標志，檢測MODS患者外周血MDSCs的變化。本研究顯示，MODS 組CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達高于非MODS組和健康對照組（P＜0.05），MODS死亡組患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋表 達 高 于MODS 生 存 組 患 者（P ＜0.05）。經 相 關 分 析，MODS 評 分 與 MODS 患 者 外 周 血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達成正相關性（P＜0.05），表明創(chuàng)傷后并發(fā)MODS的患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達明顯增高，提示它們在創(chuàng)傷后免疫功能障礙中起重要作用。

TNF－α是各種細胞因子和炎性介質失控性釋放前產生的關鍵性細胞因子，被認為是細胞因子爆發(fā)中心，能促進多種因子的釋放［16］。IL－10是由多種細胞（主要以T 淋巴細胞）產生的炎癥抑制因子，其作用是抑制炎癥反應。IL－10可以通過抑制單核巨噬細胞的抗原遞呈、細胞活化及繼發(fā)的細胞免疫應答，抑制單核細胞本身的黏附作用及其介導的黏附反應，抑制活化的單核細胞分泌IL－1、IL－6、TNF－α等炎癥促進因子，發(fā)揮其抑制炎癥反應的作用［17］。本研究顯示，MODS組血清TNFα、IL－10濃度明顯高于非MODS組和健康對照組，MODS死亡組患者血清TNF－α、IL－10濃度高于MODS生存組患者（P＜0.05）。經相關分析，TNF－α與MODS等疾病嚴重度評分值成正相關，提示血清TNF－α、IL－10水平可反映MODS患者的病情嚴重程度和預后。Logistic回歸分析顯示，嚴重創(chuàng)傷、嚴重感染和器官衰竭個數(shù)均是影響患者外周血CD14－CD11b＋CD33＋細胞表達的危險因素。

綜上所述，創(chuàng)傷后并發(fā)MODS可導致外周血MDSCs、IL－10、TNF－α水平發(fā)生變化，其變化與MODS病情發(fā)展和患者預后密切相關，因此動態(tài)監(jiān)測它們的變化對MODS的發(fā)生、發(fā)展及病情轉歸具有一定預警作用。臨床在早期據此適度地應用相關抑制劑，阻止炎癥介質的大量表達和釋放，對于防止MODS的發(fā)生是一種新的治療途徑。

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