鐘毓紅，戴 宇，張松照

（浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院檢驗科，浙江杭州310009）

乙型肝炎病毒（HBV）是一種DNA 病毒，感染HBV 將嚴重威脅人類健康。全球約20億人曾感染HBV，其中3.5億人為慢性HBV 感染者，約占全球人口的6%；我國屬于HBV 高流行地區(qū)，每年有30萬人死于HBV 感染引起的肝硬化和肝細胞癌［1］。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是廣泛用于檢測乙型肝炎病毒血清學五項標志物（HBV－M）的一項定性實驗。目前多使用ELISA 法分析體檢人群的HBV－M 陽性模式［2－3］，而對HBV－M 陰性模式分布特征的分析研究較粗略。為探討HBVM 陰性體檢人群的流行病學特點以及為制定HBV－M 陰性人群預防感染HBV 的措施提供科學依據(jù)，本課題組收集了本院2014年體檢人群的9 143例標本，對其HBV－M 陰性模式情況進行了回顧性分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年在本院進行HBV－M 檢測的體檢人群，年齡18～83歲，共9 143例。其中男5 177例，年齡為（44.27±11.00）歲；女3 966 例，年齡（42.66±11.89）歲。本研究獲得浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采集空腹靜脈血3mL，3 000r／min離心10min后分離血清。（1）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測HBVM，試劑由廈門英科新創(chuàng)有限公司提供；（2）Architech i4000全自動化學發(fā)光免疫分析儀及其配套試劑定量檢測HBsAg和HBsAb；（3）轉(zhuǎn)錄介導的擴增（TMA）法定性檢測HBV－DNA，試劑購自美國諾華生物診斷公司PROCLEIX ULTRIO?Assay及其配套的Tigris操作平臺（單人份標本檢測）；（4）熒光定量PCR 儀對HBV－DNA 反應性標本進行病毒載量測定，診斷試劑為上海復星長征醫(yī)學科學有限公司產(chǎn)品，自動熒光PCR儀為AB StepOne Plus。由持有PCR 實驗室上崗證的專業(yè)人員操作。

1.2.2 判定規(guī)則 （1）ELISA 檢測HBV－M 判定規(guī)則：HBVM ELISA 檢測結(jié)果小于臨界值（其中HBeAb檢測結(jié)果大于臨界值）判定標本為該項目ELISA 檢測陰性；ELISA 試劑檢測結(jié)果大于或等于臨界值（其中HBeAb檢測結(jié)果小于或等于臨界值）判定標本為該項目ELISA 檢測陽性。（2）HBsAg 和HBsAb定量判定規(guī)則如下，HBsAg 無反應性：＜0.05IU／mL；HBsAg反應性：≥0.05IU／mL；HBsAb無反應性：＜10 mIU／mL；HBsAb 反 應 性：≥10 mIU／mL。（3）PROCLEIX ULTRIO?Assay檢測HBV－DNA 判定規(guī)則：待測標本HBVDNA S／CO 值小于臨界S／CO 值1，判定HBV－DNA 呈無反應性；待測標本HBV－DNA S／CO 值大于或等于臨界S／CO 值1，則判定HBV－DNA 呈反應性。（4）HBV－DNA 熒光定量判定規(guī)則：檢測樣本中HBV DNA≥1.0×102IU／mL 時，按實際檢測結(jié)果報告；檢測樣本中HBV DNA ＜1.0×102IU／mL時，報告為低于定量檢出限。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，陰性率的比較使用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 體檢人群年齡、性別分布情況 共有9 143例體檢者參加本研究，見表1，男女比例為1.31∶1。體檢人群年齡集中分布在31～＜61歲，此年齡段男女比例為1.43∶1。

表1 9 143例體檢者年齡、性別分布特征

2.2 不同性別、年齡人群乙肝HBV－M 陰性的檢測情況HBV－M 陰性率在18～＜31歲年齡段較高，41～＜51歲和51～＜61歲年齡段中，男、女HBV－M 陰性率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同性別、年齡人群乙肝HBV－M 陰性的檢測情況

2.3 HBV－M 陰性標本的化學發(fā)光免疫分析法和TMA 法檢測 在300例HBV－M 陰性標本中，化學發(fā)光免疫分析法檢測出1例低濃度HBsAg標本，4例低濃度HBsAb標本；TMA 法檢測出2例HBV－DNA 反應性標本，見表3。

表3 7例HBV－M ELISA 陰性標本的HBsAg、HBsAb和HBV－DNA 反應性結(jié)果

3 討 論

HBV－M 陰性模式是體檢人群中的常見的HBV 血清學模式，一般認為此人群體內(nèi)不存在HBV，與此同時機體也不具備抵抗病毒感染的自我保護能力，屬于HBV 易感人群。

本文使用ELISA 檢測杭州地區(qū)體檢人群的HBV－M，結(jié)果顯示HBV－M 陰 性 率 為24.20%，低 于 俞 小 忠 等［2］報 道 的42.17%和梁小兵等［3］報道的40.19%，提示體檢人群HBV－M陰性率處于下降態(tài)勢，分析原因可能與體檢人群的健康意識增強，主動接種HBV 疫苗預防HBV 感染有關(guān)。本研究數(shù)據(jù)表明HBV－M 陰性人群年齡集中分布于18～＜51 歲年齡段，HBV－M 陰性率女性高于男性，由于這部分人群（尤其是女性）比較會追捧流行元素：如修足、紋身、扎耳環(huán)孔等，為HBV 提供了傳播途徑。此外，成人接種HBV 疫苗并非免費和強制性，多數(shù)成人的自我保護意識淡薄，此年齡段的HBV－M 陰性人群將是預防控制HBV 感染的重點和難點。

化學發(fā)光免疫分析法是一項新的定量分析方法，與ELISA 相比具有更高的靈敏度和測量范圍，同時能縮短檢測時間，已逐漸用于臨床檢測抗體和抗原［4］。本研究使用化學發(fā)光免疫分析法檢測出1例HBsAg低濃度標本，4例HBsAb低濃度，提示ELISA 存在漏檢HBV－M 的風險，這與王巧蓮等［5］的報道相符，這要求在具體的檢測過程中對此類HBV－M 陰性結(jié)果引起注意，必要時詢問相應體檢者的既往HBV－M 檢測結(jié)果加以確認。

由于血清學檢測存在窗口期長、免疫靜默感染和病毒變異等問題，檢測和定量HBV－DNA 在診斷和監(jiān)測HBV 感染以及評估治療反應方面發(fā)揮重要作用。Dong 等［6］使用PROCLEIX ULTRIO?Assay在178 447例無償獻血標本中檢測出94例隱匿性HBV 感染（OBI）標本，2例HBV 血清學窗口期標本。本研究中300 例HBV－M 陰性標本中有2 例為HBVDNA 反應性，其中1例標本定量結(jié)果為560IU／mL。隱匿性HBV 感染是對HBV 疫苗無應答的重要因素之一，低水平的HBV 感染對HBsAg處于免疫耐受狀態(tài)［7］。筆者未進一步區(qū)分這1例標本是否為OBI，將通過后續(xù)追蹤檢測實驗加以確定。

蔣汝剛等［8］和王德全等［9］分別指出接種常規(guī)重組酵母HBV 疫苗（HBsAg亞單位疫苗），成年人全程接種乙肝疫苗后無、弱應答率分別為12.98%和25.38%。這些無、弱應答的對象仍然對HBV 敏感，很有可能成為HBV 慢性攜帶者，成為乙肝防控工作中的難題。接種HBV 疫苗后抗體的產(chǎn)生與疫苗接種因素、飲食因素、機體發(fā)育因素、不良生活習慣和遺傳因素密切相關(guān)。接種乙肝疫苗后無或弱應答可能與人類白細胞抗原（HLA）有關(guān)，其中HLAⅡ類基因DRB1 和DRB2 與HBV疫苗接種后HBsAb反應性有關(guān)［10］。HBV 疫苗無應答者體內(nèi)具有針對HBV 感染的細胞免疫反應，能保護其抵抗HBV 的侵襲。對此，本課題組下一步將從細胞和分子水平研究HBVM 陰性體檢人群中體液免疫和細胞免疫對HBV 疫苗所起的作用。

目前人類尚無法徹底治愈HBV 感染，一般建議是對HBV 疫苗無應答或低應答且非HBV 感染者進行1次或數(shù)次加強免疫。而此類人群再次接種后應答狀況和抗體的持續(xù)時間仍是難題。第三代HBV 疫苗Sci－B－VacTM（除小S抗原外，含有前S1和前S2抗原）通過誘導機體產(chǎn)生強有力的細胞和體液免疫，使對常規(guī)HBV 疫苗無或弱反應的健康個體產(chǎn)生了保護性HBsAb［11］。與傳統(tǒng)的肌內(nèi)接種HBV 疫苗相比，皮內(nèi)接種HBV 疫苗能更好地誘導對常規(guī)疫苗無反應的機體產(chǎn)生免疫應答［12］。這些措施或許能成為HBV－M 陰性人群對常規(guī)HBV 疫苗無應答時的一種選擇。

綜上所述，HBV－M 陰性人群屬于HBV 的易感人群，建議對ELISA HBV－M 陰性的標本進行HBsAg、HBsAb和HBVDNA 定量，以確定是否存在HBV 感染；若無感染，對未接種HBV 疫苗者，及時注射HBV 疫苗；而對HBV 疫苗無（弱）應答者，應加強健康教育，改變不良習慣，通過增加接種劑量、接種時加入佐劑、進行皮內(nèi)接種或使用新型HBV 疫苗等有效措施，提高對HBV 疫苗的應答率，從而防止HBV－M 陰性人群感染HBV。

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